知母甾體皂苷抗血小板活性作用機制的研究.pdf

1、血小板是血液中由骨髓巨核細(xì)胞脫落下無核的小塊胞質(zhì)，在機體初期止血中起著重要作用。此外在病理條件下，血小板也與一些心腦血管疾病密切相關(guān)。越來越多的證據(jù)顯示，異常的血小板激活是動脈粥樣硬化形成中的一個重要因素。目前，心腦血管疾病仍然是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一，抗血小板治療成為治療此類疾病的有效策略。許多抗血小板藥物如阿司匹林（環(huán)氧合酶抑制劑）、氯吡咯雷和噻氯匹啶（ADP受體阻斷劑）對心血管疾病有很好的療效，然而，在臨床上也觀察到這些藥物存

2、在藥物抵抗、中性粒細(xì)胞減少、出血、血小板減少等副作用。因此，研發(fā)更加安全有效的抗血小板藥物是治療和預(yù)防動脈栓塞性疾病有效的途徑。
　　 甾體皂苷是一類重要的中藥活性成分，在許多植物中都含有甾體皂苷成分。它具有廣泛的藥理作用和重要的生物活性，例如防治心血管疾病、抗腫瘤、抗真菌等作用。甾體皂苷的基本骨架是由含27個碳的苷元結(jié)構(gòu)與一個或多個糖鏈連接構(gòu)成的，主要分為含一個糖鏈（主要在C3-位）的螺甾皂苷（spirostanol sapo

3、nins）和含2個糖鏈（主要在C3-及C26-位）的呋甾皂苷（furostanol saponins）。甾體皂苷具有較高的醫(yī)藥價值，已有報道多種甾體皂營具有明確的抗血小板活性作用，但目前對甾體皂苷抗血小板作用機制還了解很少。本研究的目的就是揭示甾體皂苷抗血小板活性的作用機制。
　　 我們首先篩選了六個從知母中提取和合成的單體化合物，發(fā)現(xiàn)知母皂苷AⅢ抑制血小板聚集的作用最強。進一步構(gòu)效關(guān)系分析顯示，苷元結(jié)構(gòu)和C-3位糖鏈組成和連接

4、方式與甾體皂苷抑制血小板聚集活性密切相關(guān)。體內(nèi)研究結(jié)果表明知母皂昔AⅢ延長小鼠尾靜脈出血時問，保護致死性的血栓栓塞。這些結(jié)果提示知母皂苷AⅢ是研究甾體皂苷抗血小板活性的理想小分子探針。
　　 我們進一步研究知母皂苷AⅢ抗血小板活性的作用特點。血小板激活包括變形、聚集、釋放等反應(yīng)。血小板抑制劑可以抑制血小板的激活反應(yīng)。在我們研究中，知母皂苷AⅢ抑制了血小板聚集、變形、釋放、αⅡbβ3激活、蛋白磷酸化等激活反應(yīng)。同時，知母皂苷AⅢ也

5、表現(xiàn)出其抗血小板活性的自身特點，知母皂苷AⅢ雖然劑量依賴性地抑制U46619（TXA2受體激動劑）、AA、膠原和ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，但對各誘導(dǎo)劑的敏感性不同，對U46619和AA的作用最強，這提示知母皂苷AⅢ可能阻斷TXA2生成或直接作用TXA2通路上；觀察到知母皂苷AⅢ本身也會引起血小板變形，而PGE1則沒有觀察到這一現(xiàn)象。PGE1與血小板膜上IP受體結(jié)合，激活Gs通路，升高細(xì)胞內(nèi)cAMP。升高的cAMP能阻斷多條血小板信號通路激

6、活而抑制血小板的激活反應(yīng)。然而，在我們的實驗中并未觀察到知母皂苷AIII升高血小板cAMP的作用。知母皂營AⅢ與PGE1相似，是一個有效的血小板抑制劑，但其發(fā)揮作用并不是通過升高cAMP。
　　 PKC的激活與血小板激活反應(yīng)有關(guān)，主要調(diào)節(jié)血小板的聚集和釋放。PMA激活PKC誘導(dǎo)血小板聚集和釋放，然而，知母皂苷AⅢ并沒有抑制PMA誘導(dǎo)的血小板變形和釋放，這提示知母皂苷AⅢ可能抑制PKC上游信號通路。凝血酶與血小板膜G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)

7、合，激活磷脂酶C，產(chǎn)生DAG，導(dǎo)致PKC的激活，引起血小板的釋放反應(yīng)。凝血酶激活血小板僅在低濃度作用時依賴TXA2的生成，而高濃度時不依賴TXA2的生成。使用高濃度凝血酶誘導(dǎo)血小板聚集，知母皂苷AⅢ不能抑制高濃度凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集，而選擇性抑制TXA2受體激動劑U46619介導(dǎo)的血小板聚集和釋放。我們的實驗證實了U46619、凝血酶和PMA都能誘導(dǎo)血小板ERK的磷酸化，知母皂苷AⅢ能有效地抑制U46619誘導(dǎo)ERK1/2磷酸化，而對

8、不依賴TXA2受體介導(dǎo)的凝血酶和PMA誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化沒有作用，這表明知母皂苷AⅢ能阻斷TXA2受體介導(dǎo)的信號通路的激活。血小板激活生成TXA2分泌后與血小板膜表面TXA2受體結(jié)合，而TXA2受體主要偶聯(lián)在Gq和G12/13兩條通路上，Gq通路介導(dǎo)的PLCβ激活在激動劑誘導(dǎo)的血小板聚集和釋放中有至關(guān)重要的作用；G12/13介導(dǎo)的Rho/Rho激酶途徑主要與血小板的變形有關(guān)。我們研究表明，知母皂苷AⅢ選擇性阻斷TXA2受體介導(dǎo)的G

9、q通路的激活，而不影響G12/13通路。此外，磷脂酶C抑制劑能抑制知母皂苷AIII誘導(dǎo)的血小板變形，知母皂苷AⅢ誘導(dǎo)的變形很可能由于部分激活了Gq通路。最后，我們發(fā)現(xiàn)知母皂苷AⅢ能協(xié)同TXA2受體拮抗劑SQ29548共同抑制U46619誘導(dǎo)的血小板聚集。
　　 總的來說，我們選擇知母皂苷AⅢ作為理想的小分子探針研究甾體皂昔抗血小板活性的作用機制，并在研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基礎(chǔ)上，推測TXA2受體可能是知母皂苷AⅢ抗血小板活性作用的候