P2Y12受體自發(fā)激活及Gi和G12-13通路在血小板激活和血栓形成中的作用.pdf

1、第一部分: P2Y12受體自發(fā)激活在血小板激活和血栓形成中的作用
　　隨著生活水平的提高，動脈血栓性疾病如冠心病和中風等已成為嚴重威脅我國人民健康的重要疾病。血小板異常激活引起的血管內血栓形成是這類疾病的病理基礎，抗血小板藥對于冠心病和中風的治療效果是肯定的，但其治療效果仍未盡如人意。目前臨床上廣泛應用的抗血小板藥有環(huán)氧化酶抑制劑阿司匹林，P2Y12受體拮抗劑氯吡格雷(clopidogrel)、普拉格雷(prasugrel)、替卡

2、雷洛(ticagrelor)和血小板纖維蛋白原受體拮抗劑等。阿司匹林是評價抗血栓藥物療效的金標準。雖然臨床試驗顯示氯吡格雷總體療效優(yōu)于阿司匹林，但該藥對于冠心病和中風的療效不超過50％。而血小板纖維蛋白原受體拮抗劑抗血小板作用更強，但隨之而來的出血等副作用也相應增加。所以，我們仍需要作用更強但副作用更小的抗血小板藥物。
　　作為血小板P2Y12受體拮抗劑，氯吡格雷對冠心病和中風病人的治療效果毋庸置疑。但臨床上部分病人的血小板對氯吡

3、格雷無反應，即氯吡格雷抵抗(clopidogrel resistance)，造成氯吡格雷部分臨床治療失敗。我們認為尚未發(fā)現的血小板ADP受體P2Y12突變引起的P2Y12受體自發(fā)激活可能是部分病人氯吡格雷抵抗的原因。因為我們以往的研究發(fā)現，當ADP受體P2Y12的羧基端部分被相應的P2Y1受體取代(cP2Y12)并穩(wěn)定表達在CHO-K1細胞時，能夠表現出很強的自發(fā)激活活性并維持對激動劑的正常反應，利用此細胞系我們發(fā)現氯吡格雷是一個弱的P

4、2Y12反向激動劑，這一特性決定了其對自發(fā)激活的血小板P2Y12受體僅有微弱的抑制作用，從而導致了臨床治療上的氯吡格雷抵抗。與此同時，利用此細胞系我們還發(fā)現了一種具有很強的反向激動劑活性的P2Y12受體拮抗劑AR-C78511。
　　在本研究中，我們利用Tet-on系統(tǒng)建立了一種血小板特異性表達自發(fā)激活的cP2Y12受體的轉基因小鼠。強力霉素可以特異性地在骨髓巨核細胞和血小板中誘導高水平的轉基因cP2Y12的表達。轉基因小鼠的血小

5、板對ADP、2MeSADP、AYPGKF、U46619和thrombin等血小板激活誘導劑誘導的聚集反應明顯增強，表現出血小板的高反應性。轉基因小鼠的靜息態(tài)血小板內cAMP濃度降低，且可被AR-C78511逆轉，證實了轉基因小鼠血小板P2Y12受體的自發(fā)激活活性和AR-C78511的反向激動劑活性。轉基因小鼠的出血時間縮短，氯化鐵誘導的腸系膜動脈血栓形成更快、更穩(wěn)定。這些結果提供了P2Y12受體自發(fā)激活易發(fā)血栓的直接證據，在血小板水平上

6、進一步證實了AR-C78511的反向激動劑活性，支持AR-C78511作為新型抗血小板藥用于血栓性疾病的預防、治療具有治療學優(yōu)勢。AR-C78511因其強反向激動劑活性應該具有比氯吡格雷更好的抗血小板、抗血栓作用，因此本研究為將AC-C78511研發(fā)為新型的抗血小板藥奠定了基礎。
　　第二部分Gi和G12/13信號通路在血小板激活中的作用
　　在多種生理和病理性刺激物的作用下，血小板能夠被激活并發(fā)生粘附、變形、聚集、顆粒釋放

7、和血栓素A2合成等過程而最終導致生理性止血或病理性血栓形成。血小板激活在生理性止血和病理性血栓形成中起重要作用:血管損傷時血小板激活參與損傷修復反應，對于生理止血過程十分重要;血小板異常激活導致的動脈血栓形成導致的血管狹窄或閉塞，致使機體組織局部缺血或供血中斷是冠心病、急性冠脈綜合征、中風等動脈血栓性疾病的病理基礎。經過幾十年的基礎研究和臨床實踐證明抑制血小板激活的抗血小板藥對冠心病、中風的預防、治療效果肯定，而研究血小板激活機制可以為

8、研發(fā)抗血小板藥物提供理論基礎。
　　G蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）是一大類膜蛋白受體的統(tǒng)稱，具有七個跨膜結構區(qū)。研究顯示G蛋白偶聯受體能結合細胞周圍環(huán)境中的多種化學物質從而激活細胞內的一系列信號通路，最終引起細胞狀態(tài)的改變。凝血酶、TXA2、ADP、腎上腺素、SFLLRN、AYPGKF、膠原等都能直接或間接通過激活G蛋白偶聯受體而激活血小板;和GPCR偶聯、介導GPCR激活血小

9、板的G蛋白有Gq、 Gi和G12/13等。已有研究證實Gq和Gi信號通路或者Gq和G12/13信號通路同時激活時都能夠引起血小板完全激活并發(fā)生聚集。雖然已有一些研究表明Gi和G12/13信號通路同時激活能夠引起血小板GPⅡb/Ⅲa激活和血小板聚集，但這一理論是否正確仍存在爭議。
　　我們應用多種激動劑在小鼠、大鼠和人的血小板上對此問題進行了研究，結果顯示:當低濃度的血小板激動劑雖然可引起Gi和G12/13的同時激活，但并不能引起血

10、小板激活和聚集，只有當激動劑濃度較高時血小板才發(fā)生聚集;當血小板激動劑濃度增加時，血小板內Akt和Erk1/2的磷酸化水平升高;PI3k抑制劑LY294002、Akt抑制劑SH-6和PKC抑制劑Ro31-8220能夠顯著抑制血小板聚集，因而PI3k/Akt/Erk和PKC通路在Gi和G12/13信號通路協(xié)同作用誘導的血小板聚集中起到重要作用;而Rho激酶抑制劑Y-27632、Src家族激酶抑制劑PP2及細胞內鈣離子螯合劑BAPTA-AM