P2Y12受體抑制劑對骨癌痛大鼠脊髓p38MAPK信號通路及炎性因子的影響.pdf

1、本研究分為兩部分。
　　 第一部分 P2Y12受體抑制劑對骨癌痛大鼠痛閾及脊髓p38絲裂原活化蛋白激酶表達(dá)的影響
　　 目的：鞘內(nèi)注射P2Y12受體抑制劑MRS2395，研究脊髓P2Y12受體在大鼠骨癌痛中的作用及其對p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)表達(dá)的影響。
　　 方法：雌性SD大鼠40只，用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組(n=8):正常組(N)、假手術(shù)組(S)、DMSO溶劑骨癌痛組(DA)、骨癌痛組(A)、

2、骨癌痛鎮(zhèn)痛組(MA)。N組大鼠不進(jìn)行任何處理，S組大鼠左脛骨上端骨髓腔注入Hank's液10μl，DA組、A組、MA組大鼠左脛骨上段注入經(jīng)腹水培養(yǎng)的Walker256癌細(xì)胞10μl建立骨癌痛模型。除N組外，其余四組大鼠建立骨癌痛模型的同時(shí)，選擇腰3-4間隙行鞘內(nèi)注管，建模后第9-12天各組大鼠每日分別行鞘內(nèi)注藥，S組、A組注射0.9％生理鹽水，DA組注射5％二甲基亞砜(DMSO)溶劑，MA組注射MRS2395（400pmol/μl，溶于

3、5％DMSO溶液），容量各15μl。鞘內(nèi)注藥前、后每10分鐘測量一次大鼠左后足機(jī)械痛閾。術(shù)后第12天鞘內(nèi)注藥測定機(jī)械痛閾值后，取L4-6脊髓，采用免疫組化及免疫熒光法測定脊髓背角磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：各組大鼠基礎(chǔ)痛閾值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）;建模后第9天，與N組、S組比較，DA組、A組、MA組大鼠左后足機(jī)械痛閾值下降(P＜0.01);MA組與DA組、A組比較，鞘內(nèi)注射P2Y12受

4、體抑制劑后大鼠機(jī)械痛閾值增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但與N組、S組比較，MA組機(jī)械痛閾值仍低于正常（P＜0.01）。第9-11天給藥后第20分鐘痛閾峰值，與造模后第9天首次給藥前的基礎(chǔ)痛閾值比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。采用盲法測定陽性細(xì)胞數(shù)以及IOD數(shù)值反映磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)水平:DA組、A組、MA組脊髓p-p38MAPK蛋白表達(dá)高于N組、S組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與DA組、A組比較

5、，MA組脊髓p-p38MAPK表達(dá)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;免疫熒光雙標(biāo)顯示脊髓背角p-p38MAPK與小膠質(zhì)細(xì)胞共表達(dá)，而與星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元未見共表達(dá)。
　　 結(jié)論：鞘內(nèi)注射P2Y12受體抑制劑MRS2395可能通過抑制脊髓背角的p38MAPK磷酸化程度部分減輕大鼠骨癌疼痛。
　　 第二部分 P2Y12受體抑制劑對骨癌痛大鼠脊髓IL-1β、I L-6表達(dá)的影響
　　 目的：觀察鞘內(nèi)注射P2Y

6、12受體抑制劑MRS2395對骨癌痛大鼠炎性因子表達(dá)的影響，探討P2Y12受體與炎性因子在骨癌痛發(fā)病機(jī)制中的可能作用。
　　 方法：雌性SD大鼠32只，采用隨機(jī)數(shù)字表法均分為四組(n=8):假手術(shù)組（S組）、MRS2395組（M組）、脛骨癌痛組（A組）、脛骨癌痛MRS2395鎮(zhèn)痛組（MA組）。S組:左脛骨上端骨髓腔注入Hank's液10μl，模型制備成功后第9-12天，鞘內(nèi)注射0.9％生理鹽水15μl/d;M組左脛骨上端骨髓腔注

7、入Hank's液10μl模型制備成功后第9-12天，鞘內(nèi)注射MRS2395(400 pmol/μl)15μl/d;A組:左脛骨上端骨髓腔注入Walker256癌細(xì)胞懸液10μl，模型制備成功后第9-12天，鞘內(nèi)注射0.9％生理鹽水15μl/d;MA組:左脛骨上端骨髓腔注入Walker256癌細(xì)胞懸液10μl，模型制備成功后第9-12天，鞘內(nèi)注射MRS2395(400pmol/μl)15μl/d。骨癌痛造模同時(shí)均進(jìn)行腰3-4間隙鞘內(nèi)置管，

8、術(shù)后第9-12天鞘內(nèi)注藥前、后每10分鐘測試一次大鼠左后足機(jī)械痛閾值，術(shù)后第12天鞘內(nèi)注藥測定機(jī)械痛閾值后，取L4-L6脊髓，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法測脊髓炎性因子IL-1β、IL-6的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：建模后第9天，與N組、S組比較，A組、MA組機(jī)械性痛閾值下降(P＜0.01)，與A組比較，MA組大鼠鞘內(nèi)注射MRS2395后大鼠機(jī)械痛閾值增高(P＜0.05)。Elisa結(jié)果顯示:N組與S組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05