血小板依賴Shp2和P2X1-P38的新激活機制研究.pdf

1、第一部分蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2在血小板膠原和ADP信號中的作用及機制
　　Shp2是含有兩個SH2功能域的蛋白酪氨酸磷酸酶，在多種生長因子，激素及細胞因子等應答中都發(fā)揮了重要的生物學作用。以往的研究認為，Shp2通過與血小板表面PECAM-1受體胞內(nèi)段磷酸化的ITIM結(jié)合，參與抑制GPVI信號通路，然而其具體的作用機制一直以來仍不明確。本研究進一步探索了Shp2對血小板功能的影響及可能的作用機制。結(jié)果概括為以下四點:(1)Shp

2、2的抑制劑PHPS1顯著抑制低濃度膠原和ADP引起的血小板聚集及釋放。在相當于人體動脈流速的剪切應力(1000 s-1)作用下，抑制Shp2可明顯抑制血小板在膠原表面的黏附。PHPS1可抑制血小板在固定的纖維蛋白原上的鋪展，卻不影響凝血酶引起的血塊收縮，說明Shp2參與了血小板早期的由外向內(nèi)的信號通路(outside-in signaling)，而不參與晚期的由外向內(nèi)信號通路。(2)免疫共沉淀顯示，低濃度膠原引起的血小板激活過程中Shp

3、2與Syk結(jié)合形成蛋白復合物，PHPS1能夠抑制二者結(jié)合，且該過程不依賴整合素αⅡb3。高濃度膠原刺激下，Shp2-Syk復合物不能被PHPS1所解離。(3)免疫印跡結(jié)果顯示，PHPS1能夠抑制低濃度膠原或ADP引起的血小板Akt和Erk的磷酸化水平，而不影響高濃度膠原介導的Akt/Erk磷酸化水平。(4)低濃度膠原或ADP刺激下，Syk抑制劑BAY61-3606能夠抑制血小板聚集，及下游Akt/Erk磷酸化水平。本研究驗證了血小板在低

4、濃度膠原刺激下Shp2與Syk結(jié)合，二者共同調(diào)控下游Akt/Erk磷酸化水平，并引起血小板活化。PHPS1抑制二者結(jié)合，進而影響下游Akt/Erk磷酸化水平，抑制血小板活化。在ADP信號通路中，Shp2主要參與ADP的P2Y12受體介導的信號，調(diào)控下游Akt/Erk磷酸化水平。
　　第二部分離子通道P2X1通過p38促進血栓烷A2引起的血小板聚集和釋放
　　P2X1是血小板表面表達的唯一ATP受體。雖有研究認為P2X1通過活

5、化Erk促進低濃度膠原引起的血小板活化，但P2X1的其他功能仍不明確。我們的研究發(fā)現(xiàn)ATP通過P2X1受體形成血小板激活的正反饋，ATP激活p38從而增強低濃度血栓烷A2類似物(U46619)引起的血小板聚集和釋放。P2X1的抑制劑NF449或脫敏P2X1受體均能抑制低濃度U46619引起的血小板聚集及P－選擇素表達。P2X1的刺激劑αβ-Me-ATP能夠引起p38的磷酸化，且呈現(xiàn)劑量時間依賴性。 P38的抑制劑SB203580而不是M

6、ek的抑制劑U0126能夠引起與NF449類似的抑制效果，但同時使用NF449和SB203580則沒有疊加效果，提示ATP可能通過引起p38的活化進而促進U46619引起的血小板激活。我們將P2X1受體脫敏或抑制后發(fā)現(xiàn)，U46619引起的p38磷酸化在各個時間點均明顯下降，Erk磷酸化并不受影響。而U46619激活的血小板中，p38抑制劑SB203580并不影響Erk磷酸化， Mek抑制劑U0126也不影響p38磷酸，進一步驗證了Erk