P2X-,3-和P2Y-,1-受體參與雌激素調(diào)節(jié)外周痛覺轉(zhuǎn)導(dǎo)及機制研究.pdf

1、疼痛是人體各部分受到損傷性刺激引起的不愉快的感覺,它提供軀體受到威脅的警報信號,是生命不可缺少的一種特殊保護功能。但另一方面,嚴重的慢性疼痛困擾著數(shù)以百萬計的人們,是臨床的一大難題。因而了解疼痛產(chǎn)生的機制,尋找解除疼痛的方法,是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的問題。臨床觀察早就注意到疼痛有明顯的性別差異,主要表現(xiàn)在兩個方面：1)腸激惹綜合征、間質(zhì)性膀胱炎、顳下頜關(guān)節(jié)炎等病癥多見于女性：2)這些疾病癥發(fā)生和發(fā)展與月經(jīng)周期相關(guān)。這些證據(jù)表明性激素可能參與

2、痛覺的調(diào)節(jié)。 雌激素是一種脂溶性激素,它可以通過激活靶細胞核內(nèi)受體(即ERα和ERβ),影響靶基因轉(zhuǎn)錄。這種作用往往牽涉到新蛋白的合成,需要較長的潛伏期,稱為激素的基因組作用。另一方面,雌激素還可以作用于可能存在于細胞膜上的受體,介導(dǎo)快速效應(yīng),稱為激素的非基因組作用。有證據(jù)表明,雌激素細胞膜上的“受體”與核受體(ERα和ERβ)在配體的結(jié)合特點上具有相似性,識別核受體的抗體也與細胞膜上的蛋白結(jié)合,提示核受體與“膜受體”可能具有同

3、源性。目前已發(fā)現(xiàn),ERα和ERβ廣泛分布于DRG初級傳入神經(jīng)元和外周組織細胞,提示雌激素可能影響感覺信號在傳入神經(jīng)末梢的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。 ATP不僅是一種貯能、供能物質(zhì),還是一種細胞間信息傳遞物質(zhì),通過激活P2X(配基門控性非選擇性陽離子通道)和P2Y(G-蛋白耦聯(lián))受體而產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。大量的研究證明,ATP參與痛覺的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與傳遞,表現(xiàn)在以下幾個方面：1)傷害性刺激可以使組織細胞釋放ATP;2)外源性ATP可通過激活P2X受

4、體而引起痛覺；3)P2X受體廣泛分布于感覺神經(jīng)末梢和有關(guān)中樞傳導(dǎo)通路；4)在P2X2和P2X3基因敲除小鼠,炎癥性軀體痛覺明顯低于對照小鼠,表明ATP是炎癥性痛覺的重要介質(zhì)。背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的初級感覺傳入神經(jīng)元是研究痛覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的重要模型之一。在急性分離和培養(yǎng)的DRG細胞上,P2X3受體特異性地參與痛覺的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。而炎癥條件下ATP通過P2X3受體在內(nèi)臟機械性感覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和內(nèi)臟感覺過敏中也起到起重要的作用。近年來的研究還發(fā)現(xiàn),除

5、了P2X受體(主要是P2X3受體)外,ATP參與痛覺的轉(zhuǎn)導(dǎo)和傳遞可能還有P2Y受體的參與。鞘內(nèi)注射UTP或UDP,可以顯著提高機械性傷害感受的閾值,而初級感覺傳入神經(jīng)元胞體上存在多種P2Y受體,都說明P2Y受體可能和P2X3受體一起,成為外周痛覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和傳遞中的重要成員。 因而在本課題中,作者運用全細胞膜片鉗、分子生物學(xué)及免疫組織化學(xué)等方法,從整體、細胞和受體分子水平研究雌激素對ATP介導(dǎo)的外周痛覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用。重點探討

6、正常和致炎條件下雌激素對初級感覺傳入神經(jīng)元上P2X3受體的表達與功能以及對P2Y1受體表達的影響,對于闡明疼痛的性別相關(guān)性,以及將來研制新一代的鎮(zhèn)痛劑,具有重要的意義。 實驗?zāi)Ｐ秃头椒ǎ?1.大鼠去性腺切除術(shù) 30只雌性大鼠隨機分成3組,假手術(shù)組、去卵巢組和雌激素替代組,每組10只。30只雄性大鼠也隨機分成3組,假手術(shù)組、去睪丸組和雌激素替代組,每組10只。 2.大鼠結(jié)腸炎模型 雌性大鼠40只,分

7、為4組,假手術(shù)組,假手術(shù)結(jié)腸炎組,去卵巢組和去卵巢+結(jié)腸炎組。假手術(shù)組和去卵巢術(shù)組方法同上(方法1),大鼠結(jié)腸致炎方法如下：乙醚麻醉,俯臥位,經(jīng)肛門插入導(dǎo)管約6-8cm,緩緩注入30％TNBS(溶于乙醇,按80mg/kg體重),5-7天后用于實驗。對照組經(jīng)肛門注入等量生理鹽水。大鼠去卵巢+結(jié)腸炎模型,則在去卵巢后6周前5-7天時,行大鼠結(jié)腸致炎。 雄性大鼠20只,分為2組,對照組和結(jié)腸炎組。 3.痛閾測定 分別用

8、甩尾熱痛儀和熱痛刺激儀進行熱痛閾測定。用弗萊毛(Von Frey Hair)進行機械性痛閾測定。 4.大鼠DRGP2X3、P2Y1及TRPV1受體mRNA實時定量PCR技術(shù) (1)RNA分離和cDNA合成 大鼠斷頭致死后,迅速取出8對腰骶段DRG(L1-S2),用Trizol提取液提取總RNA,紫外分光光度計測RNA純度(A260/280),同時行RNA定量。提取的RNA中,每樣本取2μg在20μl體系中反轉(zhuǎn)錄成

9、cDNA,-20℃保存,用于實時定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)擴增P2X3、P2Y1及TRPV1基因。 (2)實時定量RT-PCR 用于擴增P2X3基因的引物對為:TGGCGTTCTGGGTATTAAGATCGG(正義);CAGTGGCCTGGTCACTGGCGA(反義),反應(yīng)條件為：95℃,2min,95℃,25s：65℃,25s;72℃,25s。用于擴增P2Y1基因的引物對為：CCCTGTCGTTGAAATCACAC(正義);AC

10、GTCAGATGAGTACCTGCG(反義),反應(yīng)條件為：95℃,2min,95℃,25s;58℃,25s;72℃,25s。用于擴增TRPV1基因的引物對為:TCAATTCCCACACACCTCCC(正義);GACATGCCACCCAGCAGG(反義),反應(yīng)條件為：95℃,2min,95℃,20s：63℃,25s;72℃,25s。為標(biāo)化PCR反應(yīng)中各樣本目的基因cDNA含量,減少各樣本間因個體差異對結(jié)果分析的影響,同時對各樣本的管家基因

11、β-actin進行了擴增,引物對為:ATGGTGGGTATGGGTCAGAAGG(正義);TGGCTGGGGTGTTGAAGGTC(反義),反應(yīng)條件為：95℃,2min：95℃,25s：58℃,25s：72℃,25s。 5.大鼠DRGP2X3受體免疫組化技術(shù) 大鼠斷頭致死,迅速取出腰段DRG,置于含4％多聚甲醛的0.1M的PBS中(pH7.2),過夜,然后將組織塊轉(zhuǎn)入含25％蔗糖的PBS中,直到組織塊沉入底部。然后將組織

12、迅速冷凍,并在Leica冷凍切片機上切成薄片,貼于明膠鋪過的載玻片上。用0.02 M PBS沖洗三次,每次5分鐘。在含10％馬血清、0.2％Triton的PBS中預(yù)孵育30分鐘,然后用P2X3、TRPV1抗體孵育,這些抗體用含10％馬血清、0.2％Triton X-100和0.4％疊氮化納的PBS稀釋成1:200或1:400,25℃放置過夜。用PBS沖洗后,將結(jié)合Cy3的驢抗兔IgG用含1％NHS的PBS稀釋成1:200,常溫下孵育切片

13、2小時。最后沖洗切片,用NIKON熒光顯微鏡觀察結(jié)果。 6.大鼠DRG分離培養(yǎng)細胞的全細胞膜片鉗記錄 將酶解得到的DRG分離細胞置入記錄小室,并以1ml/min的速度用細胞外液灌流。常溫下進行全細胞膜片鉗記錄,所用儀器為Axopatch 200B放大器。鉗制電壓為-60mV。記錄膜電流應(yīng)用低通濾波(10KHz,-3dB)。數(shù)據(jù)用pClamp9.0記錄并處理。用EXCEL進行t檢驗。原始圖用Ciampfit(pCLAMP

14、software)記錄并用Origin7繪圖。 所有的藥物稀釋后通過ALA-VM8灌流系統(tǒng)給予,其中一管給予正常Kreb's液,用來快速終止給藥。激動劑每次給予4s,間隔2min。灌流用外液成分(mmol/L);NaCl 154,KCl 4.7,MgCl2 1.2,CaCl2 2.5,Hepes 10及glucose 5.6;用NaOH將pH值調(diào)成7.4.記錄電極電阻2～5MΩ。所充電極內(nèi)液成分為(mmol/L):KCl 120

15、,HEPES 10,tripotassium citrate 10和EGTA 10;用KOH將pH值調(diào)成7.2。 結(jié)論： 1、在雌性大鼠,隨著雌激素濃度增高,其外周機械性痛閾明顯增高,而熱痛閾明顯降低。雄性大鼠去睪丸后外周機械性痛閾和熱痛閾均無明顯改變,而給予雌激素替代后,機械性痛閾增高,熱痛閾降低。提示外周痛覺改變和體內(nèi)雌激素水平的變化有關(guān)。 2、實時定量RT-PCR和免疫組化實驗證實,雌二醇可以通過雌激素受體

16、ER,明顯抑制DRG中P2X3 mRNA,增加P2Y1 mRNA。提示雌激素可以通過基因組機制,調(diào)節(jié)初級感覺傳入神經(jīng)元中P2X3和P2Y1受體的表達,從而對痛覺信號的初級傳入起到調(diào)節(jié)作用。 3、在分離培養(yǎng)的DRG細胞上,雌二醇可以通過膜上ER的類似位點,經(jīng)過PKC和PKA途徑,快速抑制P2X3受體介導(dǎo)的瞬時型電流和雙相型電流的快速成分,但對緩慢型電流無影響。提示雌激素可以通過非基因組機制,特異性地抑制初級感覺傳入神經(jīng)元上P2X3

17、受體的功能。 4、大鼠去卵巢后結(jié)腸致炎,腰骶段DRG中P2X3mRNA稍降低,而結(jié)腸中P2X3mRNA顯著降低,在其分離培養(yǎng)的DRG細胞上,雌二醇也通過ER快速調(diào)節(jié)P2X受體介導(dǎo)的瞬時型、雙相型和緩慢型電流。提示雌激素也可以通過基因組機制和非基因組機制,對于炎癥條件下的內(nèi)臟感覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起到調(diào)節(jié)作用。 因而,我們認為,雌激素可以通過基因組機制或非基因組機制,調(diào)節(jié)DRG小直徑神經(jīng)元上ATP受體的表達和功能,從而對正常及腸道炎