雌激素對(duì)P2X3受體介導(dǎo)的外周痛覺(jué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的快速抑制作用.pdf

1、[研究目的]
　　 疼痛是人體各部分受到損傷性刺激引起的不愉快的感覺(jué)，它提供軀體受到威脅的警報(bào)信號(hào)，是生命不可缺少的一種特殊保護(hù)功能。但另一方面，嚴(yán)重的慢性疼痛困擾著數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的人們，是臨床的一大難題。因而了解疼痛產(chǎn)生的機(jī)制，尋找解除疼痛的方法，是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。臨床觀察早就注意到疼痛有明顯的性別差異，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：①腸易激綜合征(IrritableBowelSyndrome，IBS)、間質(zhì)性膀胱炎(Inter

2、stitialCystitis，IC)、顳下頜關(guān)節(jié)炎等病癥多見(jiàn)于女性；②這些病癥與月經(jīng)和性激素周期相關(guān)[1]。這些證據(jù)表明雌激素可能參與痛覺(jué)的調(diào)節(jié)。
　　 ATP不僅是一種供能物質(zhì)，而且還通過(guò)與特異的受體結(jié)合發(fā)揮神經(jīng)遞質(zhì)的作用。這種特異性ATP受體即為“嘌呤受體”，按激動(dòng)劑的選擇性分為P1和P2兩大類(lèi)。P2受體被分為P2X和P2Y兩大類(lèi)，目前已有7種P2X受體蛋白序列被克隆出來(lái)(P2X1-P2X7)。而目前研究的較多的是P2X3

3、受體，它一般在胞漿表達(dá)，在胞膜發(fā)揮作用，選擇性地表達(dá)于初級(jí)傳入感覺(jué)神經(jīng)元如背根神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)節(jié)和結(jié)狀神經(jīng)節(jié)上，且以中、小型神經(jīng)節(jié)細(xì)胞為主。P2X3受體可由脊神經(jīng)節(jié)胞體合成后轉(zhuǎn)運(yùn)到中樞端與外周端，其中樞端軸突末梢投射入脊髓背角的Ⅱ?qū)由畈?，外周端分布至皮膚、舌體和內(nèi)臟等器官[2]。運(yùn)用P2X3受體選擇性拮抗劑A-317491、反義寡核苷酸、RNA干擾和基因敲除技術(shù)后，痛覺(jué)敏感性顯著降低，進(jìn)一步表明ATP和P2X3受體參與并調(diào)制多種疼痛信號(hào)

4、的傳遞[3]。
　　 在體內(nèi)，雌激素與其特異性受體結(jié)合后發(fā)揮生物學(xué)作用。經(jīng)典的雌激素受體(ER)是核受體超家族成員之一，分為α和β兩種亞型，他們廣泛分布于各種組織，介導(dǎo)雌激素的多種效應(yīng)。在神經(jīng)系統(tǒng)中，ERs也有廣泛分布。神經(jīng)解剖學(xué)研究顯示，ERα和ERβ廣泛分布于痛覺(jué)傳遞和調(diào)制通路中，如背根神經(jīng)節(jié)、脊髓背角(主要分布在板層Ⅱ，在板層Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ和Ⅹ也有一定程度的分布)、中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)、臂旁核、脊核、下丘腦、大腦邊緣系統(tǒng)和幾個(gè)皮

5、質(zhì)區(qū)等區(qū)域[4]。由于ERα、β是核受體，雌激素必須穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞才能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，所以，作用比較慢。然而，近些年研究發(fā)現(xiàn)，雌激素還有快速作用(幾分鐘內(nèi))，這表明雌激素可以與細(xì)胞膜上某種蛋白結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮作用，后來(lái)人們發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜上存在一種雌激素受體GPR30[5]。也有人發(fā)現(xiàn)，雌激素核受體也可以轉(zhuǎn)移到膜上參與完成這種快速作用[6]。
　　 因而在本課題中，我們運(yùn)用動(dòng)物行為學(xué)、全細(xì)胞膜片鉗等方法，從整體、細(xì)胞水平研究雌激素

6、對(duì)P2X3受體介導(dǎo)的外周痛覺(jué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的快速調(diào)節(jié)作用。重點(diǎn)探討急性炎癥條件下雌激素對(duì)初級(jí)感覺(jué)傳入神經(jīng)元(DRG)上P2X3受體的功能影響，對(duì)于闡明疼痛的性別相關(guān)性，以及將來(lái)研制新一代的鎮(zhèn)痛劑，具有重要的意義。
　　 [研究方法]
　　 電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)：
　　 急性分離培養(yǎng)小鼠或大鼠背根神經(jīng)節(jié)(dorsalrootganglion，DRG)神經(jīng)元，通過(guò)全細(xì)胞膜片鉗方法記錄P2X3受體介導(dǎo)的瞬時(shí)型ATP電流，并給與一定濃

7、度的雌二醇(E2)或相應(yīng)雌激素受體的激動(dòng)劑，并且給予相關(guān)細(xì)胞信號(hào)通路酶的抑制劑，觀察α，β-me-ATP介導(dǎo)的電流的變化。
　　 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)：
　　 1、雌二醇(E2)對(duì)外周痛覺(jué)的抑制作用
　　 (1)E2對(duì)外周機(jī)械痛閾的影響
　　 16只雌性Sprague-Dawley大鼠，分為saline和E2兩組，分別在左腳足底皮下注射saline和E2后，以機(jī)械刺激(VonFreyfilaments)為研究方法，

8、分別于注射后0、10、30、50、70、90min觀察兩組的縮腿閾值(PWT)的差異。
　　 (2)E2對(duì)α，β-me-ATP誘導(dǎo)的外周自發(fā)痛的影響
　　 16只雌性Sprague-Dawley大鼠，分為saline和E2兩組，分別在左腳足底皮下注射saline+α，β-me-ATP和E2+α，β-me-ATP，觀察注射后縮腿時(shí)間(PWD)的差異。
　　 2、ERα及GPR30激活對(duì)P2X3受體介導(dǎo)的外周痛覺(jué)的抑

9、制作用
　　 (1)ERα激活抑制了P2X3受體介導(dǎo)的外周痛覺(jué)
　　 24只雌性Sprague-Dawley大鼠，分為Ethanol、PPT、DPN三組，分別在左腳足底皮下注射Ethanol+α，β-me-ATP、PPT+α，β-me-ATP和DPN+α，β-me-ATP，觀察注射后縮腿時(shí)間(PWD)的差異。
　　 (2)GPR30激活抑制了P2X3受體介導(dǎo)的外周痛覺(jué)
　　 16只雌性Sprague-Da

10、wley大鼠，分為DMSO、G-1兩組，分別在左腳足底皮下注射DMSO+α，β-me-ATP、G-1+α，β-me-ATP、觀察注射后縮腿時(shí)間(PWD)的差異。
　　 3、ERK1/2途徑參與了雌二醇(E2)對(duì)P2X3受體介導(dǎo)的外周痛覺(jué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的快速抑制作用
　　 32只雌性Sprague-Dawley大鼠，分為saline、E2、U0126和E2+U0126四組，分別在左腳足底皮下注射saline+α，β-me-ATP

11、、E2+α，β-me-ATP、U0126+α，β-me-ATP和E2+α，β-me-ATP+U0126，觀察注射后縮腿時(shí)間(PWD)的差異。
　　 [結(jié)果]
　　 電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)：
　　 1、在ERα、ERβ受體野生型和基因敲除型鼠分離培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元細(xì)胞上，野生型鼠中，雌二醇(E2)可以快速抑制P2X3受體介導(dǎo)的電流；而在ERα受體敲除鼠中，雌二醇(E2)對(duì)P2X3受體介導(dǎo)的電流沒(méi)有明顯影響；在ERβ受體敲除鼠

12、中，雌二醇(E2)可以部分抑制P2X3受體介導(dǎo)的電流。
　　 2、ERα特異性激動(dòng)劑PPT、GPR30特異性激動(dòng)劑G-1均能抑制P2X3受體介導(dǎo)的電流，ERβ特異性激動(dòng)劑DPN對(duì)P2X3受體介導(dǎo)的電流沒(méi)有明顯的影響。GPR30拮抗劑G-15能逆轉(zhuǎn)E2對(duì)P2X3受體介導(dǎo)的電流的抑制作用。
　　 3、ERK1/2拮抗劑U0126能逆轉(zhuǎn)ERα特異性激動(dòng)劑PPT、GPR30特異性激動(dòng)劑G-1對(duì)P2X3受體介導(dǎo)的電流的抑制作用。<

13、br>　　 4、另一個(gè)ERK1/2拮抗劑PD98059能逆轉(zhuǎn)E2對(duì)P2X3受體介導(dǎo)的電流的抑制作用行為學(xué)實(shí)驗(yàn)：
　　 1、弗萊毛(VonFreyfilaments)測(cè)試顯示，在正常雌性大鼠中，saline組和E2組PWT有顯著差異，50min后，E2組顯著高于saline組，且E2組PWT隨時(shí)間逐漸降低。
　　 2、在α，β-me-ATP誘導(dǎo)的急性炎性痛模型的雌性大鼠中，saline組和E2組間PWD有顯著性差異，E2

14、組低于saline組。
　　 3、在α，β-me-ATP誘導(dǎo)的急性炎性痛模型的雌性大鼠中，Ethanol組、PPT組和DPN組間PWD有顯著差異，PPT組低于Ethanol組，但DPN組與Ethanol組沒(méi)有明顯差異，表明了ERα受體激活對(duì)P2X3受體介導(dǎo)的外周痛覺(jué)的抑制作用。
　　 4、在α，β-me-ATP誘導(dǎo)的急性炎性痛模型的雌性大鼠中，DMSO組和G-1組間PWD有差異顯著，G-1組的PWD低于DMSO組，表明了

15、GPR30激活對(duì)P2X3受體介導(dǎo)的外周痛覺(jué)的抑制作用。
　　 5、在α，β-me-ATP誘導(dǎo)的急性炎性痛模型的雌性大鼠中，saline組、E2組、U0126組和E2+U0126組間PWD有顯著差異，U0126組與saline組間無(wú)顯著差異。E2組顯著低于saline組，E2+U0126組顯著高于E2組，但E2+U0126組與saline組沒(méi)有明顯差異，提示了U0126能逆轉(zhuǎn)E2對(duì)P2X3受體介導(dǎo)的外周痛覺(jué)的抑制作用，即ERK1/

16、2途徑參與了這種作用。
　　 [結(jié)論]
　　 1、ERα受體敲除后，雌二醇(E2)對(duì)P2X3受體介導(dǎo)的電流抑制作用消失：ERβ受體敲除后，雌二醇(E2)對(duì)P2X3受體介導(dǎo)的電流仍存在部分抑制作用。
　　 2、ERα特異性激動(dòng)劑PPT快速抑制P2X3受體介導(dǎo)的瞬時(shí)電流；ERβ特異性激動(dòng)劑DPN對(duì)P2X3受體介導(dǎo)的瞬時(shí)電流沒(méi)有明顯影響。
　　 3、GPR30特異性激動(dòng)劑G-1快速抑制P2X3受體介導(dǎo)的瞬時(shí)電流

17、；雌二醇(E2)對(duì)P2X3受體介導(dǎo)的瞬時(shí)電流的抑制作用可以被GPR30特異拮抗劑G-15阻斷。
　　 4、ERK1/2抑制劑U0126能阻斷PPT、G-1對(duì)于P2X3受體介導(dǎo)的電流抑制作用，另一個(gè)ERK1/2抑制劑PD98059能阻斷雌二醇(E2)對(duì)于P2X3受體介導(dǎo)的電流抑制作用。
　　 5、雌二醇(E2)、PPT、G-1快速抑制P2X3受體介導(dǎo)的外周痛覺(jué)，DPN無(wú)明顯作用。
　　 6、ERK1/2的抑制劑U0