AMPK對腫瘤細(xì)胞中TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及功能的抑制作用.pdf

1、背景:腫瘤已成為人類健康的主要威脅，腫瘤的危害主要來自腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。腫瘤干細(xì)胞（CSC）是腫瘤轉(zhuǎn)移的種子細(xì)胞，能夠在全新組織環(huán)境定植、生存、繁殖。間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腫瘤細(xì)胞侵潤、轉(zhuǎn)移的啟始步驟，也是已分化腫瘤細(xì)胞重獲自我更新、繁殖分化潛能等干細(xì)胞特性的途徑。因此，EMT/CSC被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥和復(fù)發(fā)的根源。轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）作為 EMT的重要誘導(dǎo)因子，與腫瘤轉(zhuǎn)移、血管新生、病理分期、病人預(yù)后密切相關(guān)。多種固體腫瘤

2、中，TGF-β過量表達(dá)，并伴有下游分子表達(dá)或活性升高，活躍的 TGF-β信號促進(jìn)了中晚期腫瘤的發(fā)展。Bmi-1是TGF-β信號的下游靶分子之一，參與EMT和CSC自我更新的主要癌基因，與腫瘤的惡性程度、浸潤轉(zhuǎn)移及療效預(yù)后都有密切關(guān)系。眾多科學(xué)家相信通過調(diào)控 TGF-β/Smad信號通路的活性和抑制 Bmi-1蛋白表達(dá)有助于抑制EMT/CSC，發(fā)揮抑癌功能。
　　代謝重組是決定腫瘤細(xì)胞存活的重要因素。流行病學(xué)資料表明，肥胖、糖尿病等

3、代謝性疾病患者發(fā)生腫瘤的風(fēng)險明顯高于其它人群，而二甲雙胍等降糖藥物的應(yīng)用有助降低腫瘤發(fā)生風(fēng)險。多項研究表明，以二甲雙胍為代表的AMPK激活劑（AICAR、苯乙雙胍、A769962）具有抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力；并且AMPK主要上游激酶LKB1對惡性腫瘤轉(zhuǎn)移也有明顯的抑制作用，而且多種腫瘤組織的AMPK-Thr172磷酸化明顯低于癌旁或正常組織。
　　AMPK的抑癌功能是公認(rèn)的，激活A(yù)MPK能夠增強(qiáng)能量瓶頸和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)對腫瘤

4、過度增殖的限制功能，抑制增殖，促進(jìn)凋亡。因此，基因突變（如LKB1的突變）和腫瘤組織微環(huán)境改變所導(dǎo)致的 AMPK活性下降成為腫瘤發(fā)展的重要原因。但目前關(guān)于AMPK對腫瘤轉(zhuǎn)移、EMT的抑制機(jī)制尚未能深入研究，本研究探討了 TGF-β信號的過度活躍是否與 AMPK活性下降有關(guān)，以及激活A(yù)MPK能否抑制TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、EMT、Bmi-1表達(dá)等熱點(diǎn)問題，對于腫瘤治療有重要意義。
　　目的:探討LKB1/AMPK對TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、E

5、MT、Bmi-1表達(dá)及細(xì)胞遷移等生物行為的抑制作用。
　　材料與方法:
　　1、細(xì)胞株包括：胃癌細(xì)胞AGS，SGC-7901，肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞，肺上皮細(xì)胞BEAS-2B，MEF，MDA-MB-231，NMuMG，MCF10A。
　　2、以shRNA敲除LKB1，或以慢病毒導(dǎo)入LKB1基因，構(gòu)建LKB1表達(dá)不同的細(xì)胞株，給予二甲雙胍等AMPK激活劑預(yù)處理，再用TGF-β1刺激，然后以免疫印跡技術(shù)檢測AMPK磷酸化、S

6、mad磷酸化以及EMT標(biāo)志物的變化。
　　3、將 AMPK顯性失活的突變體和顯性活化的突變體轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，檢測AMPK磷酸化、Smad磷酸化以及EMT標(biāo)志物的變化。
　　4、以Q-PCR檢測LKB1、AMPK化學(xué)激活劑對TGF-β下游靶基因mRNA表達(dá)的影響。
　　5、以細(xì)胞劃痕或Transwell技術(shù)檢測細(xì)胞遷移速率，分析激活A(yù)MPK對細(xì)胞遷移的影響。
　　6、收集糖尿病人血清，分為服用二甲雙胍和未服用患者；收集

7、小鼠服用二甲雙胍前后的血清。以ELISA技術(shù)檢測人和小鼠血清TGF-β水平。
　　7、以熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測激活 AMPK對 TGF-β1轉(zhuǎn)錄水平，Smad轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的影響。
　　結(jié)果:
　　一、AMPK對TGF-β表達(dá)的抑制作用
　　通過螢光素酶報告基因分析發(fā)現(xiàn)二甲雙胍、苯乙雙胍處理后，TGF-β轉(zhuǎn)錄活性下降了50％；以ELISA分析人血清TGF-β1水平，結(jié)果表明服用二甲雙胍患者的TGF-β1水平低于未

8、服用者，但結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異，可能受病例不足影響；進(jìn)一步動物實(shí)驗，發(fā)現(xiàn)小鼠服用二甲雙胍后血中TGF-β1水平明顯低于服用前；以上結(jié)果提示，激活A(yù)MPK對TGF-β生成有抑制作用。
　　二、LKB1/AMPK對TGF-β誘導(dǎo)Smad磷酸化的抑制作用
　　激活A(yù)MPK導(dǎo)致TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制。乳腺癌細(xì)胞MCF10A和肺腺癌細(xì)胞A549LKB1中，給予二甲雙胍激活A(yù)MPK可以減弱Smad2/3磷酸化水平；另外，將AMPK持續(xù)激活突

9、變體轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞，AMPK磷酸化增強(qiáng)， Smad2/3磷酸化減弱。在LKB1表達(dá)缺乏細(xì)胞（如A549細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞）中轉(zhuǎn)入LKB1基因，提高LKB1表達(dá)可以減弱TGF-β誘導(dǎo)Smad磷酸化，結(jié)果提示LKB1參與了AMPK對TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制作用。
　　AMPK失活致使TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)。以顯性失活A(yù)MPK?1突變體抑制C4-2細(xì)胞內(nèi)源性AMPK、敲除MEF細(xì)胞中的AMPKα1和α2基因，或以shRNA

10、敲除乳腺癌細(xì)胞MCF10A中LKB1和AMPKα1等途徑阻止AMPK活化后， TGF-β1誘導(dǎo)的Smad2/3磷酸化均明顯增強(qiáng)。
　　三、LKB1/AMPK對TGF-β誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的抑制作用
　　LKB1/AMPK對細(xì)胞遷移的抑制作用，在細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗中，TGF-β刺激能促進(jìn)A549細(xì)胞、NuMG細(xì)胞、AGS細(xì)胞的遷移速率，而AMPK激活劑二甲雙胍和A769962對此有明顯抑制作用，而且LKB1的表達(dá)可以增

11、強(qiáng)這種抑制作用。抑制AMPK活性致使細(xì)胞遷移速率明顯加快，通過顯性失活A(yù)MPK?1突變體抑制C4-2細(xì)胞內(nèi)源性AMPK活性后，細(xì)胞遷移明顯加快，而以多西環(huán)素恢復(fù)AMPK功能又可以抑制細(xì)胞遷移。另外，以shRNA敲除BEAS-2B細(xì)胞的LKB1后，細(xì)胞遷移速率明顯增加。
　　四、LKB1/AMPK對TGF-β誘導(dǎo)EMT的抑制作用
　　A549細(xì)胞中，經(jīng)TGF-β1長時間刺激后，上皮細(xì)胞特征的標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下降，

12、間質(zhì)細(xì)胞特征性標(biāo)志物N-cadherin和Slug表達(dá)上升；同時給予苯乙雙胍和TGF-β1能抑制TGF-β1誘導(dǎo)EMT變化，引起E-cadherin表達(dá)水平增加， N-cadherin和Slug水平下降。乳腺上皮細(xì)胞NMuMG細(xì)胞，受TGF-β1因子刺激后，細(xì)胞形態(tài)向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變，伴有E-cadherin表達(dá)下降，而N-cadherin，β-catenin， vimentin和Slug表達(dá)增加；二甲雙胍或AICAR能減弱TGF-β所誘導(dǎo)

13、NMuMG細(xì)胞的間質(zhì)細(xì)胞特征，逆轉(zhuǎn)以上反應(yīng)。在胃癌細(xì)胞AGS中，TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受二甲雙胍激活A(yù)MPK的抑制后， E-cadherin逐漸增強(qiáng)，而N-cadherin、β-catenin、Vimentin等標(biāo)志物逐漸減弱，呈時間依賴性。
　　五、LKB1/AMPK對TGF-β靶基因表達(dá)的調(diào)控作用
　　Q-PCR檢測表明：二甲雙胍對PAI-1、FN、CTGF、IL-6等4種TGF-β靶基因的表達(dá)水平無明顯影響，而TGF-β能

14、誘導(dǎo)PAI-1、FN、CTGF、IL-6等4基因的表達(dá)。但是，二甲雙胍對 TGF-β誘導(dǎo)基因表達(dá)有抑制作用，而且該抑制作用在LKB1高表達(dá)的細(xì)胞中更加明顯。
　　六、LKB1/AMPK對Bmi-1基因表達(dá)的抑制作用
　　二甲雙胍刺激A549細(xì)胞引起p-AMPK-Thr172表達(dá)升高，同時使Bmi-1的表達(dá)下降。LKB1高表達(dá)的細(xì)胞中， Bmi-1表達(dá)減弱，而LKB1低表達(dá)的細(xì)胞則Bmi-1表達(dá)更高。胃癌細(xì)胞SGC-7901和