AMPK對(duì)BMP信號(hào)通路以及異位骨化的抑制作用.pdf

1、第一部分引言
　　異位骨化（Heterotopic ossification,HO）是指在軟組織中病理形成異常的骨組織。一般發(fā)生在兩個(gè)單獨(dú)的患者群體中：具有嚴(yán)重創(chuàng)傷包括大面積燒傷、肌肉骨骼損傷、矯形手術(shù)甚至脊髓損傷的患者;和進(jìn)行性肌肉骨化癥（Fibrodysplasia ossificans progressiva,FOP）等遺傳性疾病患者中。FOP由I型骨形態(tài)發(fā)生蛋白（ Bone morphogenetic proteins,B

2、MP）受體 ALK2（ Activin receptor-like kinase2,活化素1型受體）中的永久性活化突變引起。這些病理性異位骨形成的臨床后遺癥，包括非愈合性創(chuàng)傷、慢性疼痛和關(guān)節(jié)不動(dòng)性。對(duì)于FOP，患者由于胸廓順應(yīng)性的損失導(dǎo)致呼吸困難而死亡。
　　BMPs以及其轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)通路在異位骨化形成中具有重要作用。BMPs是異位骨化的主要誘導(dǎo)者；軟組織創(chuàng)傷后刺激BMPs分泌和激活BMP信號(hào)通路，促進(jìn)軟組織形成HO。此外,大約95

3、％的FOP患者發(fā)生BMPI型受體(ALK2)突變（R206H），引起B(yǎng)MP信號(hào)通路持續(xù)性激活，表現(xiàn)為漸近性異位骨化的特性。
　　異位骨化是一個(gè)非常普遍和嚴(yán)重的健康問(wèn)題，目前臨床上使用的方法一般是減少疼痛，修復(fù)以及預(yù)防。大多依賴于抗炎藥物的使用，但其效果充其量是部分有效。而且大量的副作用限制了NSAIDs的使用。一個(gè)有效的、理想的策略是特異性的針對(duì)BMP信號(hào)通路成分，抑制異位骨化，另一個(gè)有創(chuàng)新性的策略是鑒定現(xiàn)有臨床上治療其他藥物，重

4、新發(fā)現(xiàn)其治療效果來(lái)滿足臨床需求。
　　眾多研究表明AMP-激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)在骨代謝中發(fā)揮重要的生理作用，AMPK激活劑二甲雙胍是2型糖尿病一線藥物，已經(jīng)在臨床上廣泛使用超過(guò)半個(gè)世紀(jì)。我們課題組前期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能夠有效性的抑制 TGFβ家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和 EMT。繼續(xù)延伸此研究，探索 AMPK對(duì)BMP信號(hào)通路以及異位骨化的作用。因此，我們首先研究了AMPK對(duì)FOP成纖

5、維細(xì)胞中BMP信號(hào)通路的抑制作用以及分子機(jī)制；然后將FOP成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成多能干細(xì)胞（iPS cells），進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)，進(jìn)一步檢測(cè)了AMPK對(duì)成骨分化的抑制作用；為了探索不同細(xì)胞的反應(yīng)性，繼續(xù)檢測(cè)AMPK對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞 BMP信號(hào)通路的影響和作用機(jī)制，研究不同 AMPK激活劑（單獨(dú)使用或者聯(lián)合使用）對(duì)成骨分化的影響，確定劑量效應(yīng)和協(xié)同效應(yīng)；最后建立小鼠異位骨化模型以及檢測(cè)AMPK激活劑對(duì)體內(nèi)異位骨化的抑制作用。我們的研究結(jié)

6、果明確 AMPK對(duì) BMP信號(hào)通路以及成骨分化和異位骨化的抑制作用，也為現(xiàn)有臨床使用的AMPK激活劑如二甲雙胍、阿司匹林用于預(yù)防、治療FOP疾病和異位骨化提供科學(xué)依據(jù)。
　　第二部分 AMPK對(duì)FOP成纖維細(xì)胞中BMP信號(hào)通路的抑制作用
　　目的：檢測(cè)AMPK激活是否抑制BMP信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)以及探索AMPK可能的作用機(jī)制。
　　方法：DNA測(cè)序檢測(cè) FOP成纖維細(xì)胞是否發(fā)生 ALK2 R206H突變;不同AMPK激活劑處

7、理FOP細(xì)胞，Western blot檢測(cè)AMPK對(duì)BMP信號(hào)通路成分表達(dá)的影響；構(gòu)建LKB1、AMPK12穩(wěn)定敲除MEF細(xì)胞株，觀察不同細(xì)胞株對(duì)BMP和二甲雙胍的反應(yīng)性；感染持續(xù)性激活A(yù)MPK腺病毒激活A(yù)MPK和顯示負(fù)性AMPK腺病毒失活A(yù)MPK，確定二甲雙胍對(duì)BMP的信號(hào)通路作用是通過(guò)AMPK介導(dǎo)的；構(gòu)建熒光素酶互補(bǔ)結(jié)合實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，觀察AMPK對(duì)Smad6與Smurf1、ALK2與Smad1相互作用的影響；轉(zhuǎn)染Smad6 siRNA和

8、Smurf1 siRNA以及用蛋白酶體抑制劑MG132處理細(xì)胞，探索AMPK對(duì)BMP信號(hào)通路抑制作用的分子機(jī)制。
　　結(jié)果：DNA測(cè)序確認(rèn)FOP成纖維細(xì)胞發(fā)生ALK2 R206H突變；不同AMPK激活劑激活A(yù)MPK并且抑制Smad1/5的磷酸化；感染持續(xù)性激活A(yù)MPK突變體抑制 BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而感染 AMPK顯性負(fù)性突變體后，取消了二甲雙胍對(duì)Smad1/5磷酸化的抑制作用；穩(wěn)定敲除LKB1和AMPK12表達(dá)后，二甲雙胍不能抑制B

9、MP6誘導(dǎo)的Smad1/5的磷酸化。AMPK激活抑制ALK2的表達(dá)但上調(diào)Smad6和Smurf1的表達(dá)；AMPK激活后促進(jìn)Smad6和Smurf1的結(jié)合，但阻遏ALK2和Smad1的相互作用；Smad6和Smurf1基因沉默后，消除了AMPK對(duì)BMP信號(hào)通路的抑制作用。此外，結(jié)果還顯示蛋白酶體抑制MG132能夠消除AMPK促進(jìn)ALK2降解的作用。
　　結(jié)論：AMPK激活劑或者使用持續(xù)性激活 AMPK突變體激活 AMPK抑制Smad

10、1/5的磷酸化；二甲雙胍對(duì)Smad1/5的磷酸化抑制是通過(guò)AMPK介導(dǎo)的；AMPK激活抑制 FOP成纖維細(xì)胞中 BMP信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，AMPK激活后上調(diào)Smad6和Smurf1表達(dá)、增強(qiáng)兩個(gè)分子之間的相互作用，隨后引起ALK2降解增加，從而抑制BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　第三部分 AMPK抑制來(lái)源于FOP成纖維細(xì)胞的iPS的成骨分化
　　目的：研究AMPK激活對(duì)來(lái)源于FOP成纖維細(xì)胞的iPS的成骨分化影響。
　　方法：建立、鑒

11、定來(lái)源于 FOP成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（FOP-iPS）;誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,通過(guò)茜素紅染色和Western blot檢測(cè)成骨分化標(biāo)記物表達(dá)來(lái)觀察ALK2突變(FOP iPS)和野生型ALK2(Control iPS)的iPS誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化能力的區(qū)別；采用茜素紅染色檢測(cè)AMPK激活劑（二甲雙胍、AICAR）對(duì)iPS細(xì)胞礦化的影響。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建來(lái)源于FOP成纖維細(xì)胞的iPS細(xì)胞(FOP iPS);與對(duì)照iPS

12、相比較，F(xiàn)OP iPS茜素紅染色程度更強(qiáng)，成骨分化標(biāo)記物RunX2、Osx和OPN表達(dá)水平更高；AMPK激活劑二甲雙胍、AICAR抑制iPS誘導(dǎo)的細(xì)胞礦化。
　　結(jié)論：攜帶ALK2突變的FOP iPS細(xì)胞誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的能力更強(qiáng);AMPK抑制來(lái)源于FOP成纖維細(xì)胞的iPS的成骨分化。
　　第四部分 AMPK對(duì)小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞中BMP信號(hào)通路的抑制作用
　　目的：探討AMPK對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞中B

13、MP信號(hào)通路的影響以及探索可能的分子作用機(jī)制。
　　方法：AMPK激活劑二甲雙胍處理MC3T3-E1細(xì)胞不同時(shí)間或者不同濃度， Western blot檢測(cè)AMPK對(duì)BMP信號(hào)通路成分表達(dá)的影響,觀察AMPK對(duì)Smad6、Smurf1和ALK2等表達(dá)的改變；感染持續(xù)性激活A(yù)MPK腺病毒激活A(yù)MPK，觀察AMPK對(duì)BMP信號(hào)通路的直接效應(yīng)；轉(zhuǎn)染Smad6 siRNA，沉默Smad6表達(dá)，探索AMPK對(duì)BMP信號(hào)通路抑制作用的分子機(jī)制

14、。
　　結(jié)果：二甲雙胍和持續(xù)性激活A(yù)MPK突變體激活A(yù)MPK抑制BMP6誘導(dǎo)的Smad1/5的磷酸化；AMPK激活后上調(diào)Smad6表達(dá)但不改變Smurf1和ALK2的表達(dá)；Smad6基因沉默后，二甲雙胍不能抑制BMP6誘導(dǎo)的Smad1/5的磷酸化， 消除了AMPK對(duì)BMP信號(hào)通路的抑制作用。
　　結(jié)論：AMPK激活抑制MC3T3-E1細(xì)胞中BMP信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，AMPK激活后通過(guò)上調(diào)Smad6表達(dá)，抑制BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

15、,Smad6是AMPK主要靶目標(biāo)。
　　第五部分 AMPK抑制MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化
　　目的：探討AMPK對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響。
　　方法：MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)在誘導(dǎo)成骨分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，分別采用Western bolt和qPCR檢測(cè)不同時(shí)間段（0、1、3、7、14、21天） AMPK活性和成骨細(xì)胞分化標(biāo)記物OPN、Osx和Runx2的改變；觀察AMPK活性和成骨分化之間的

16、關(guān)系；感染持續(xù)性激活A(yù)MPK腺病毒激活A(yù)MPK和顯性負(fù)性AMPK腺病毒失活A(yù)MPK，觀察AMPK對(duì)堿性磷酸酶活性的影響;堿性磷酸酶染色檢測(cè)不同AMPK激活劑（單獨(dú)使用或者聯(lián)合使用）對(duì)成骨分化早期階段的影響；茜素紅染色檢測(cè)不同AMPK激活劑對(duì)成骨分化晚期階段-細(xì)胞礦化的影響。
　　結(jié)果：AMPK活性隨著成骨細(xì)胞分化程度越高其活性逐漸降低，而成骨細(xì)胞分化標(biāo)記物OPN和Osx在第14天呈現(xiàn)最高表達(dá)，Runx2在成骨分化期間表達(dá)未發(fā)生明顯

17、改變；AMPK激活劑包括二甲雙胍、阿司匹林、姜黃素和布洛芬等抑制堿性磷酸酶活性，并呈現(xiàn)濃度依賴性；感染AMPK持續(xù)性活性突變體也顯示同樣效應(yīng)，然而感染AMPK顯性負(fù)性突變體失活A(yù)MPK活性和功能后，取消二甲雙胍對(duì)堿性磷酸酶活性的抑制作用；二甲雙胍和布洛芬聯(lián)用對(duì)堿性磷酸酶活性抑制具有超疊加效應(yīng)，而二甲雙胍和姜黃素聯(lián)用顯示疊加效應(yīng)。二甲雙胍和阿司匹林抑制MC3T3-E1細(xì)胞礦化，并呈現(xiàn)濃度依賴性。
　　結(jié)論：AMPK在成骨細(xì)胞分化過(guò)程

18、中發(fā)揮重要作用，成骨分化程度越高， AMPK活性越低；AMPK激活抑制MC3T3-E1成骨細(xì)胞分化,包括早期階段和晚期階段。二甲雙胍和布洛芬聯(lián)合應(yīng)用具有超疊加效應(yīng)可能通過(guò)不同機(jī)制抑制堿性磷酸酶活性。二甲雙胍和姜黃素聯(lián)用具有疊加效應(yīng)可能通過(guò)相似機(jī)制抑制堿性磷酸酶活性。
　　第六部分 AMPK對(duì)小鼠體內(nèi)異位骨化形成的影響
　　目的：初步探討AMPK對(duì)小鼠體內(nèi)異位骨化形成的影響。
　　方法：建立創(chuàng)傷-燒傷異位骨化小鼠模型，同

19、時(shí)采用二甲雙胍干預(yù)（飲用水含有0.5mg/ml的二甲雙胍，N=5），連續(xù)8周后，采用X-RAY掃描檢測(cè)異位骨的形成；取異位骨化組織，固定，脫鈣，進(jìn)行HE染色觀察組織學(xué)改變，阿爾新藍(lán)（Alcian Blue）染色檢測(cè)二甲雙胍對(duì)軟骨內(nèi)形成改變；qPCR檢測(cè)成骨細(xì)胞分化標(biāo)記物（包括Osc、BSP、RunX2）以及Smad6、Smurf1的mRNA表達(dá)的改變。
　　結(jié)果：通過(guò)創(chuàng)傷-燒傷方法成功建立小鼠異位骨化模型，術(shù)后8周，進(jìn)行X-RAY