辣椒素對(duì)大鼠DRG神經(jīng)元VGCCs的抑制作用及其抑制通路的研究.pdf

1、目的：感覺神經(jīng)元的電壓門控性鈣通道（VGCCs）在痛覺信號(hào)的傳遞過程中起重要作用，有研究表明，辣椒素能抑制VGCCs，并使傷害性感受器脫敏。本研究應(yīng)用膜片鉗和鈣離子成像技術(shù)研究辣椒素（Cap）對(duì)急性分離的大鼠背根神經(jīng)節(jié)（DRG）神經(jīng)元VGCCs的抑制效應(yīng)并探討其細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　 方法：⑴DRG神經(jīng)元的分離雄性SD 大鼠，體重80～120g，清潔級(jí)。斷頭處死，取胸段脊柱，置于混合氣（95％O2+5％CO2）飽和的0℃的D

2、MEM 液中，縱向剪開椎管，分離DRG，并隨即將其置于含胰蛋白酶（0.5mg/ml，I 型）和膠原酶（1 mg/ml,IA 型）的DMEM 液中，在恒溫水?。?7℃）中消化30 分鐘。消化完畢，用DMEM液反復(fù)清洗四次，然后用不同口徑的吸管吹打，使DRG 神經(jīng)元分散成單個(gè)細(xì)胞形成細(xì)胞懸液，用吸管吸取細(xì)胞懸液滴在小玻片上靜置30 分鐘，待細(xì)胞貼壁后加細(xì)胞外液于培養(yǎng)皿中，放置于4℃冰箱，在6 小時(shí)內(nèi)可用于實(shí)驗(yàn)。⑵鈣離子成像鈣離子成像技術(shù)可監(jiān)

3、測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度（[Ca2+]I）的變化。[Ca2+]I的測(cè)量采用一種Ca2+敏感性的熒光染料Fura-2 acetoxymethyl ester(Fura-2/AM)。在37℃ 用含有2 μmol/L的Fura-2/AM的外液孵育DRG 神經(jīng)元30min，結(jié)合Ca2+的Fura-2/AM的激發(fā)光波長(zhǎng)是340 nm，未結(jié)合Ca2+的Fura-2/AM的激發(fā)光波長(zhǎng)是380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)均為510 nm。這樣就可以用340 nm和

4、380 nm這兩個(gè)熒光的比值定量[Ca2+]I的變化。利用鈣離子成像分析軟件TILLvision軟件，可實(shí)時(shí)檢測(cè)[Ca2+]I的變化。⑶全細(xì)胞膜片鉗記錄VGCC 電流以及辣椒素誘導(dǎo)的電流通過膜片鉗技術(shù)記錄。鉗制電極由微電極拉制儀拉制而成，然后經(jīng)拋光儀對(duì)電極尖端拋光。在電極充灌內(nèi)液后，使電極尖端的入水電阻為3至5。使電極與細(xì)胞膜達(dá)到一定度的髙阻抗封接，然后將電極尖端鉗制的膜吸破，則全細(xì)胞模式建立。將膜電位鉗制在70 mV，用去極化脈沖（0

5、 mV，200 ms）誘發(fā)VGCC 電流。用辣椒素（1μmol/L）灌流神經(jīng)元，通過觀測(cè)辣椒素是否引起DRG 神經(jīng)元產(chǎn)生內(nèi)向電流檢測(cè)該神經(jīng)元對(duì)辣椒素的敏感性。膜片鉗實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行。⑷統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Igor Pro軟件（美國(guó)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，組間均數(shù)比較用非配對(duì)t 檢驗(yàn)，p<0.05認(rèn)為差異有顯著性。
　　 結(jié)果：①在辣椒素敏感性DRG 神經(jīng)元，給予辣椒素（1 μmol/L）可以引起

6、細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)向陽(yáng)離子電流（辣椒素電流），可通透Ca2+，可以引發(fā)胞內(nèi)游離Ca2+濃度瞬時(shí)升高。在辣椒素不敏感的DRG 神經(jīng)元，給予辣椒素（1 μmol/L）不能引起細(xì)胞產(chǎn)生任何電流效應(yīng)和細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度瞬時(shí)升高。②在辣椒素敏感性DRG 神經(jīng)元，辣椒素（1 μmol/L）能可逆地抑制VGCC 電流和抑制由高鉀（40 mmol/L）介導(dǎo)的電壓門控性Ca2+內(nèi)流。辣椒素抑制VGCCs的效應(yīng)依賴于胞內(nèi)Ca2+濃度顯著升高。而在辣椒素不敏感的

7、DRG 神經(jīng)元，辣椒素對(duì)VGCC 電流及其介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流無(wú)明顯的抑制作用。③辣椒素對(duì)VGCCs的抑制效應(yīng)可被蛋白激酶C（PKC）選擇性抑制劑Bisindolylmaleimide 顯著性減弱，而蛋白激酶A（PKA）選擇性抑制劑H-89 對(duì)此抑制效應(yīng)無(wú)顯著性影響。提示PKC 參與了辣椒素對(duì)VGCCs的抑制。
　　 結(jié)論：在辣椒素敏感性的DRG神經(jīng)元，辣椒素對(duì)VGCCs具有抑制作用，這種抑制作用途徑是通過升高細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+和