柴胡皂苷a對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元癲癇樣放電抑制作用及相關(guān)離子通道電流調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、一、目的:
　　 癲癇是常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，是一組由大腦神經(jīng)元反復(fù)異常同步化放電所引起的短暫中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的慢性腦部疾病。據(jù)1997年WHO統(tǒng)計(jì)全球約有5000萬(wàn)癲癇患者，2003年國(guó)內(nèi)癲癇流行病學(xué)調(diào)查表明:我國(guó)癲癇患病率約為7.0％，以此推算我國(guó)約有600萬(wàn)患者正遭受癲癇的困擾。癲癇反復(fù)發(fā)作、病程長(zhǎng)、致殘率高嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。臨床常用抗癲癇藥物，不能有效控制癲癇發(fā)作，仍有約40％的癲癇患者產(chǎn)生耐藥性，且

2、多數(shù)抗癲癇藥有多種急慢性不良反應(yīng)及毒副作用，部分藥物價(jià)格昂貴，長(zhǎng)期服用給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的心理壓力和巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。只有明確癲癇發(fā)病機(jī)制，才能指導(dǎo)有效性高、安全性好的抗癲癇藥物的研發(fā)。
　　 癲癇發(fā)作是由神經(jīng)遞質(zhì)及其受體異常、離子通道異常、膠質(zhì)細(xì)胞活性、免疫因素、遺傳因素等各種原因引起大腦神經(jīng)元興奮性-抑制性動(dòng)態(tài)失衡，神經(jīng)元興奮性增高、異常同步化放電引起。離子通道是擔(dān)負(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性活動(dòng)（即神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏膫鲗?dǎo)）以及形

3、成神經(jīng)環(huán)路（即神經(jīng)元間突觸信號(hào)的傳遞）的核心構(gòu)件，任何離子通道的基因突變都可能異化通道蛋白的正常功能，造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性-抑制性動(dòng)態(tài)失衡，神經(jīng)元興奮性增高，最終引起神經(jīng)元異常同步化放電，導(dǎo)致癲癇發(fā)作。離子通道分為電壓門控離子通道，如電壓依賴性K+通道、電壓依賴性Na+通道，和配體依賴性離子通道，如NMDA受體(NMDAR)通道等。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)、膜片鉗等技術(shù)的發(fā)展，作為神經(jīng)元之間或神經(jīng)元與效應(yīng)細(xì)胞之間藉以傳遞各種生理和病理信

4、息的核心媒介，離子通道與癲癇發(fā)病機(jī)制的研究已愈來(lái)愈引起神經(jīng)科科研工作者的重視。
　　 借助實(shí)驗(yàn)性癲癇模型模擬人類癲癇發(fā)作，從電生理學(xué)角度探討癲癇的發(fā)病機(jī)制已成為當(dāng)前本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。無(wú)鎂外液誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元自發(fā)性反復(fù)性癲癇樣放電（spontaneous recurrent epileptiform discharges，SREDs）模型是目前國(guó)際公認(rèn)的模擬人類后天獲得性癲癇(acquired epilepsy，AE)

5、的細(xì)胞模型，而持續(xù)性高頻癲癇樣放電(continuous epileptiform high-frequency bursts，SEs)模型是模擬人類持續(xù)性癲癇(status epilepticus，SE)的細(xì)胞模型，兩種癲癇細(xì)胞模型目前被廣泛應(yīng)用于癲癇狀態(tài)下神經(jīng)元生物化學(xué)、神經(jīng)電生理學(xué)、分子生物學(xué)改變的機(jī)制研究及抗癲癇藥物篩選的研究中;4-氨基吡啶(4-aminopyridine，4AP)誘導(dǎo)的海馬腦片神經(jīng)元癲癇樣放電模型與人類顳葉癲

6、癇發(fā)作時(shí)腦電圖記錄的放電模式相似，是篩選抗癲癇藥物研究的經(jīng)典體外癲癇模型，能較為客觀地反映藥物的抗癲癇作用。
　　 癲癇屬于中醫(yī)“癇病”范疇，《黃帝內(nèi)經(jīng)素問(wèn)·卷二十一·六元正紀(jì)大論篇第七十一》曰:“木郁之發(fā)，太虛?；?，云物以擾，大風(fēng)乃至，屋發(fā)折木，木有變。故民病胃脘當(dāng)心而痛，上支兩脅，鬲咽不通，食飲不下，甚則耳鳴眩轉(zhuǎn)，目不識(shí)人，善暴僵仆”，我國(guó)歷代醫(yī)家認(rèn)為“肝失疏泄、肝氣郁結(jié)”是癲癇發(fā)病的病因病機(jī)之一，并提出癲癇“從肝論治”的中

7、醫(yī)理論，在此理論的指導(dǎo)下，課題組自擬方“柴胡疏肝湯”在臨床癲癇的預(yù)防和治療中取得客觀療效，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)“柴胡疏肝湯”能夠降低戊四氮(PTZ)點(diǎn)燃模型大鼠的癇性發(fā)作潛伏期及發(fā)作級(jí)別，減輕鋰-匹羅卡品誘發(fā)的難治性癲癇模型大鼠的癲癇發(fā)作級(jí)別，在前期研究基礎(chǔ)上逐步篩選出復(fù)方中君藥柴胡的有效成分柴胡皂苷a(Saikosaponin a，SSa)并發(fā)現(xiàn)SSa能夠抑制最大電休克模型(MES)、PTZ急性致癇模型及鋰-匹羅卡品模型誘發(fā)的癇性發(fā)作

8、。
　　 為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)SSa的抗癲癇作用并探討SSa的抗癲癇機(jī)制，本研究運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，從電生理學(xué)角度觀察了SSa對(duì)無(wú)鎂外液誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元癲癇樣放電及4AP誘導(dǎo)的大鼠內(nèi)嗅皮層-海馬腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)元癲癇樣放電的抑制作用，并進(jìn)一步觀察了SSa對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元癲癇相關(guān)離子通道電流，包括NMDAR電流、Na+通道電流及K+通道電流的調(diào)節(jié)作用，明確SSa抗癲癇作用的電生理機(jī)制，為癲癇“從肝論治”的中醫(yī)理論提供較

9、為直觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 二、方法:
　　 1.原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元及熒光免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定
　　 出生＜24h的新生SD大鼠，無(wú)菌條件下斷頭取腦、分離海馬，常規(guī)海馬組織消化、離散細(xì)胞后以2.5×104/ml的密度接種在放有圓形玻片的24孔培養(yǎng)板中，以Neurobasal-A+10％B-27培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。選取生長(zhǎng)至第10d的海馬神經(jīng)元，用Ⅲβ-Tubulin/GFAP及DAPI熒光三標(biāo)免疫細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)行染色標(biāo)記

10、，計(jì)算綠色熒光標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞占藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞的百分比。
　　 2.無(wú)鎂誘導(dǎo)原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元損傷及SSa的干預(yù)作用
　　 選取培養(yǎng)至第10 d的海馬神經(jīng)元，隨機(jī)分為空白組、無(wú)鎂損傷組、苯妥英組和SSa組，空白組以正常細(xì)胞外液孵育;無(wú)鎂損傷組以無(wú)鎂細(xì)胞外液孵育;苯妥英組以含有50μM苯妥英的無(wú)鎂細(xì)胞外液孵育;SSa組以含有1μM SSa的無(wú)鎂細(xì)胞外液孵育，10 min后以Ⅲβ-Tubulin熒光免疫細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)行染色

11、標(biāo)記，對(duì)比、評(píng)估SSa對(duì)無(wú)鎂外液引起的大鼠海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用。
　　 3.SSa對(duì)原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元靜息膜電位(Vm)及興奮性的影響
　　 選取培養(yǎng)至第10-14 d的海馬神經(jīng)元，隨機(jī)分為空白組（Control）、苯妥英組和SSa組，空白組以正常細(xì)胞外液干預(yù);苯妥英組以含有50μM苯妥英的正常細(xì)胞外液干預(yù);SSa組以含有1μM SSa的正常細(xì)胞外液干預(yù)。在全細(xì)胞膜片鉗電流鉗記錄模式下，觀察并比較不同干預(yù)處理后海

12、馬神經(jīng)元Vm的變化率，及以大小為150 pA，時(shí)間為600 ms的去極化方波電流刺激海馬神經(jīng)元誘發(fā)的動(dòng)作電位(action potential，AP)個(gè)數(shù)的變化率，評(píng)估SSa對(duì)原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元興奮性的影響。
　　 4.無(wú)鎂外液誘導(dǎo)原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元SREDs樣放電及SSa的干預(yù)作用
　　 選取培養(yǎng)至第10-14d的大鼠海馬神經(jīng)元，以無(wú)鎂外液孵育3h后，置于正常細(xì)胞外液中孵育24 h，誘發(fā)海馬神經(jīng)元SREDs樣放

13、電。在全細(xì)胞膜片鉗電流鉗記錄模式下，出現(xiàn)典型SREDs樣放電的神經(jīng)元隨機(jī)分為無(wú)鎂組、苯妥英組(50μM)及SSa各劑量（分別為0.1μM、0.3μM、0.5μM、1μM、2μM和4μM）組，觀察并比較不同處理組對(duì)海馬神經(jīng)元SREDs樣放電的抑制率，評(píng)估SSa對(duì)無(wú)鎂外液誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元SREDs樣放電的抑制作用。
　　 5.無(wú)鎂外液誘導(dǎo)原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元SEs樣放電及SSa的干預(yù)作用
　　 選取培養(yǎng)至第10

14、-14 d的大鼠海馬神經(jīng)元，以無(wú)鎂外液持續(xù)灌流孵育＞10min，誘發(fā)海馬神經(jīng)元SEs樣放電。在全細(xì)胞膜片鉗電流鉗記錄模式下，出現(xiàn)典型SEs樣放電的神經(jīng)元隨機(jī)分為無(wú)鎂組、苯妥英組(50μM)及SSa各劑量（分別為0.1μM、0.3μM、0.5μM、1μM、2μM和4μM）組，觀察并比較不同處理組對(duì)海馬神經(jīng)元SEs樣放電的抑制率，評(píng)估SSa對(duì)無(wú)鎂外液誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元SEs樣放電的抑制作用。
　　 6.4AP誘導(dǎo)大鼠內(nèi)嗅皮

15、層-海馬腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)元癲癇樣放電及SSa的干預(yù)作用
　　 選取出生25-50 d的SD大鼠，吸入乙醚麻醉后，于振動(dòng)切片機(jī)上切取厚300-400μm的內(nèi)嗅皮層-海馬腦片，以正常人工腦脊液(ACSF)37℃孵育1h后，以含有100μM4AP的ACSF持續(xù)灌流孵育20-40 min誘發(fā)海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元癲癇樣放電。在全細(xì)胞膜片鉗電流鉗記錄模式下，出現(xiàn)典型癲癇樣放電的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元隨機(jī)分為4AP組、丙戊酸鈉(VPA)

16、組(1 mM)及SSa各劑量（分別為0.1μM、0.3μM、0.5μM、1μM、2μM和4μM）組，觀察并比較不同藥物干預(yù)后，海馬神經(jīng)元癲癇樣放電持續(xù)時(shí)間及放電頻率的變化率，評(píng)估SSa對(duì)4AP誘導(dǎo)大鼠內(nèi)嗅皮層-海馬腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)元癲癇樣放電的抑制作用。
　　 7.SSa對(duì)原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元NMDAR電流的調(diào)節(jié)作用
　　 選取培養(yǎng)至第10-14 d的大鼠海馬神經(jīng)元，隨機(jī)分為NMDA(Control)組、APV組(

17、50μM)、苯妥英組(50μM)及SSa各劑量（分別為0.1μM、0.3μM、0.5μM、1μM、2μM和4μM）組，在全細(xì)胞膜片鉗電壓鉗記錄模式下，以含有100μM NMDA的無(wú)鎂細(xì)胞外液通過(guò)“Y型”給藥系統(tǒng)快速給藥，誘發(fā)海馬神經(jīng)元NMDAR電流，觀察并比較不同藥物干預(yù)后，NMDAR電流的變化率，評(píng)估SSa對(duì)NMDAR電流的調(diào)節(jié)作用。
　　 8.SSa對(duì)原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元電壓依賴性Na+通道電流的調(diào)節(jié)作用
　　 選

18、取培養(yǎng)至第10-14 d的大鼠海馬神經(jīng)元，隨機(jī)分為Control組、苯妥英組(50μM)及SSa各劑量（分別為0.1μM、0.3μM、0.5μM、1μM、2μM和4μM）組，在全細(xì)胞膜片鉗電壓鉗記錄模式下，以大小為-80 mV到+20 mV，持續(xù)時(shí)間為2 s的緩慢去極化的斜波（Ramp）電壓刺激海馬神經(jīng)元，誘發(fā)電壓依賴性持續(xù)性Na+通道電流（INaP）;以大小為-70 mV到0 mV，持續(xù)時(shí)間為30 ms的去極化方波(Step)電壓刺激

19、海馬神經(jīng)元，誘發(fā)電壓依賴性瞬時(shí)Na+通道電流(INat)，觀察并比較不同藥物干預(yù)后，INaP和INat的變化率，評(píng)估SSa對(duì)INaP和INat的調(diào)節(jié)作用。
　　 9.SSa對(duì)大鼠海馬腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)元電壓依賴性K+通道電流的調(diào)節(jié)作用
　　 選取出生25-50 d的SD大鼠，吸入乙醚麻醉后，于振動(dòng)切片機(jī)上切取大鼠海馬腦片，隨機(jī)分為Control組及SSa組（1μM），在全細(xì)胞膜片鉗電壓鉗記錄模式下，以一-120 mV，

20、持續(xù)時(shí)間為300 ms的超極化電壓脈沖，緊接之后是從-60 mV到+60 mV，步階為+10mV，持續(xù)時(shí)間為400 ms的去極化Step脈沖刺激海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元，誘發(fā)總電壓依賴性K+通道電流（ITotal）;給予一-120 mV，持續(xù)時(shí)間為200 ms的超極化電壓預(yù)脈沖，緊接之后是去極化至-40 mV，持續(xù)時(shí)間為100 ms的預(yù)脈沖，之后是從-60 mV到+60 mV，步階為+10 mV，持續(xù)時(shí)間為400 ms的去極化Step脈沖

21、刺激神經(jīng)元，誘發(fā)電壓依賴性持續(xù)性K+通道電流(IK)，電壓依賴性瞬時(shí)K+通道電流（IA）通過(guò)Clampfit10.0軟件將記錄到的ITotal和IK相減得到。并以一持續(xù)時(shí)間為120 ms，從-90 mV到+10mV，步階為+10 mV的Step預(yù)脈沖，之后是去極化至+50 mV，持續(xù)時(shí)間為80 ms的單脈沖刺激神經(jīng)元，誘發(fā)IA失活電流。觀察并比較不同處理組對(duì)電壓門控性ITotal、IK和IA激活及失活特性的影響，評(píng)估SSa對(duì)電壓依賴性外

22、向性K+通道電流的調(diào)節(jié)作用。
　　 分別以含有20 mM四乙銨（tetraethylammonium，TEA）或4 mM4AP的ACSF孵育海馬腦片2 min后，以去極化至+10mV，持續(xù)時(shí)間為400 ms的單脈沖刺激，誘發(fā)外向性K+通道電流，觀察不同干預(yù)組對(duì)TEA敏感和4AP敏感的外向性K+通道電流的影響，評(píng)估SSa對(duì)藥物敏感外向性K+通道電流的調(diào)節(jié)作用。
　　 10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)

23、軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，各處理組對(duì)神經(jīng)元Vm、AP的調(diào)節(jié)作用及對(duì)4AP誘導(dǎo)的癲癇樣放電持續(xù)時(shí)間、NMDAR電流、INaP和IAat的抑制率均采用單因素方差分析(one-wayAVOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間兩兩比較，方差齊采用LSD法，方差不齊采用Dunnett's T3法;對(duì)SERDs樣放電頻率抑制率、SE樣放電頻率抑制率及對(duì)4AP誘導(dǎo)的癲癇樣放電頻率抑制率采用單樣本t檢驗(yàn);對(duì)電壓依賴性K+通道電流特

24、性的調(diào)節(jié)作用采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 三、結(jié)果:
　　 1.原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元及熒光免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定
　　 神經(jīng)元在培養(yǎng)至第10 d分化成熟，可見細(xì)胞散在生長(zhǎng)，胞體飽滿，折光性強(qiáng)，軸突形成密集的神經(jīng)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，熒光顯微鏡下可見大部分細(xì)胞呈綠色熒光，Ⅲβ-Tubulin綠色陽(yáng)性細(xì)胞占全部細(xì)胞的96.132％±2.164％。
　　 2.SSa對(duì)無(wú)鎂誘導(dǎo)原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元

25、損傷的保護(hù)作用
　　 鏡下觀，經(jīng)無(wú)鎂外液孵育后的海馬神經(jīng)元，神經(jīng)元胞體皺縮，甚至溶解，軸突斷裂，SSa組神經(jīng)元胞體飽滿、突觸較完整，提示SSa能抑制無(wú)鎂外液誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元的損傷。
　　 3.SSa對(duì)原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元Vm及興奮性的影響
　　 各組對(duì)原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元Vm無(wú)顯著調(diào)節(jié)作用(F=1.997，P=0.155)，與Control組相比較，SSa(1μM)對(duì)Vm無(wú)顯著調(diào)節(jié)作用(P=0.0

26、56);各組對(duì)AP的抑制率有顯著性差異(F=108.178，P＜0.001)，與Control組相比較，1μM SSa作用5 min后，能顯著抑制去極化電流誘發(fā)的平均AP的個(gè)數(shù)(P＜0.001)，提示在不影響神經(jīng)元一般膜特性的前提下，SSa能夠抑制原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元的興奮性。
　　 4.SSa對(duì)無(wú)鎂外液誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元SREDs樣放電的抑制作用
　　 在全細(xì)胞電流鉗記錄模式下，Control組海馬神經(jīng)元在

27、灌流正常細(xì)胞外液下呈現(xiàn)出單個(gè)偶發(fā)AP的發(fā)放，這是原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元的基本電生理活性;經(jīng)無(wú)鎂外液孵育3h的原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，經(jīng)正常培養(yǎng)液孵育24 h后，在正常細(xì)胞外液下出現(xiàn)多個(gè)典型的自發(fā)性反復(fù)的癲癇樣放電即SREDs樣放電。
　　 記錄圖像顯示，含有0.1μM、0.3μM、0.5μM、1μM、2μM和4μM濃度SSa的正常細(xì)胞外液作用后，海馬神經(jīng)元SREDs發(fā)放個(gè)數(shù)及持續(xù)時(shí)間均逐漸減少甚至消失，經(jīng)正常細(xì)胞外液進(jìn)行洗脫后SRE

28、Ds樣放電再次出現(xiàn)，提示SSa對(duì)無(wú)鎂外液誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元SREDs樣放電的抑制作用是可逆的。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，不同濃度的SSa作用后，無(wú)鎂外液誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元SREDs樣放電的發(fā)作有不同程度的減少。與無(wú)鎂組相比較，除0.1μM作用濃度外(P=0.170)，0.3μM、0.5μM、1μM、2μM及4μM濃度的SSa均能夠顯著抑制海馬神經(jīng)元SREDs樣放電，抑制率分別為19.167±4.182％、66.433±4.950％、95

29、.160±3.317％、98.000±1.216％、98.571±1.118％，P值均＜0.001，SSa對(duì)無(wú)鎂外液誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元SREDs樣放電的抑制作用在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度依賴性，半數(shù)有效劑量為0.42μM。
　　 5.SSa對(duì)無(wú)鎂外液誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元SEs樣放電的抑制作用在全細(xì)胞電流鉗記錄模式下，Control組海馬神經(jīng)元在灌流正常細(xì)胞外液下呈現(xiàn)出單個(gè)偶發(fā)AP的發(fā)放，這是原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元

30、的基本電生理活性，海馬神經(jīng)元經(jīng)持續(xù)無(wú)鎂外液灌流孵育＞10 min后，出現(xiàn)典型的持續(xù)性高頻癲癇樣放電即SEs樣放電。
　　 記錄圖像顯示，含有0.1μM、0.3μM、0.5μM、1μM、2μM和4μM濃度SSa的無(wú)鎂細(xì)胞外液作用后，原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元SEs樣放電頻率逐漸減少甚至消失，經(jīng)無(wú)鎂外液進(jìn)行洗脫后，SEs樣放電再次出現(xiàn)，提示SSa對(duì)無(wú)鎂誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元SEs樣放電的抑制作用是可逆的。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，各濃度的SSa均能抑制無(wú)

31、鎂外液誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元SEs樣放電。與無(wú)鎂組相比較，除0.1μM作用濃度外(P=0.005)，0.3μM、0.5μM、1μM、2μM及4μM濃度的SSa均能夠顯著抑制海馬神經(jīng)元SEs樣放電，抑制率分別為12.071±
　　 5.794％、43.418±4.441％、73.626±3.384％、93.538±4.474％、97.798±2.023％，P值均＜0.001，而苯妥英對(duì)原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元SEs樣放電無(wú)顯著

32、抑制作用(P=0.082)。不同濃度的SSa對(duì)無(wú)鎂誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元SEs樣放電的抑制作用不同，呈現(xiàn)一定程度的濃度依賴性，半數(shù)有效劑量為0.62μM。
　　 6.SSa對(duì)4AP誘導(dǎo)的大鼠內(nèi)嗅皮層-海馬腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)元癲癇樣放電的抑制作用
　　 全細(xì)胞電流鉗記錄模式下，Control組大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元呈現(xiàn)出單個(gè)偶發(fā)AP的發(fā)放，這是大鼠海馬腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的基本電生理活性;經(jīng)含有100μM4AP的ACSF

33、持續(xù)灌流孵育大鼠海馬腦片20-40 min后，CA1區(qū)錐體神經(jīng)元逐漸出現(xiàn)穩(wěn)定的促發(fā)性癲癇樣放電。
　　 記錄圖像顯示，經(jīng)0.1μM、0.3μM、0.5μM、1μM、2μM和4μM不同濃度的SSa作用后，錐體神經(jīng)元促發(fā)性癲癇樣放電持續(xù)時(shí)間逐漸減少，癲癇樣放電發(fā)放間歇期逐漸延長(zhǎng)，經(jīng)含有100μM4AP的ACSF進(jìn)行洗脫后可見用藥前促發(fā)性癲癇樣放電再次出現(xiàn)，提示SSa對(duì)4AP誘導(dǎo)的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元癲癇樣放電的抑制作用是可逆的。統(tǒng)

34、計(jì)結(jié)果顯示，各處理組對(duì)CA1區(qū)錐體神經(jīng)元癲癇樣放電持續(xù)時(shí)間的抑制作用有顯著差異（F=457.286，P＜0.001）。與4AP組相比較，除0.1μM作用濃度外(P=0.145)，0.3μM、0.5μM、1μM、2μM和4μM作用濃度的SSa均能顯著減少CA1區(qū)錐體神經(jīng)元癲癇樣放電持續(xù)時(shí)間，抑制率分別為26.448±6.788％、40.059±3.264％、57.212±3.231％、67.928±1.908、74.876±2.380％，

35、P值均＜0.001;與4AP組相比較，各濃度的SSa對(duì)4AP誘導(dǎo)的錐體神經(jīng)元癲癇樣放電頻率的抑制率均顯著升高，抑制率分別為7.750±2.053％、25.875±2.475％、43.250±1.982％、57.250±3.105％、68.625±3.114％、74.750±2.493％，P值均＜0.001，而VPA組對(duì)4AP誘導(dǎo)的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元癲癇樣放電頻率無(wú)顯著抑制作用（P=0.170）。不同濃度的SSa對(duì)4AP誘導(dǎo)的大鼠海馬

36、CA1區(qū)錐體神經(jīng)元促發(fā)性癲癇樣放電的抑制作用不同，呈現(xiàn)一定程度的濃度依賴性，半數(shù)有效劑量為0.70μM。
　　 7.SSa對(duì)原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元NMDAR電流的調(diào)節(jié)作用
　　 在全細(xì)胞電壓鉗記錄模式下，通過(guò)“Y型”給藥系統(tǒng)向培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元局部快速滴加含有100μM NMDA的無(wú)鎂細(xì)胞外液后，誘發(fā)出一粗壯的快速內(nèi)向電流，這種內(nèi)向電流能夠被NMDAR阻斷劑APV完全阻斷，表明所記錄到的內(nèi)向電流為NMDAR電流。
　

37、　 各處理組對(duì)NMDAR電流的抑制作用有顯著性差異(F=662.526，P=0.000)。與Control組相比較，0.1μM、0.3μM、0.5μM、1μM、2μM和4μM濃度的SSa均能顯著減少誘發(fā)的NMDAR電流幅度，抑制率分別為1.070±0.136％、6.108±0.245％、15.015±0.219％、29.853±1.679％、37.726±1.956％、39.224±2.433％，P值均＜0.001，且SSa對(duì)NMDA

38、R電流的抑制作用在一定濃度范圍內(nèi)有劑量依賴性，半數(shù)抑制劑量為0.62μM。
　　 8.SSa對(duì)原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元INaP和INat的調(diào)節(jié)作用
　　 在全細(xì)胞電壓鉗記錄模式下，選用-80 mV到+20 mV的緩慢去極化Ramp脈沖刺激海馬神經(jīng)元，誘發(fā)出一種緩慢激活的陡峭的內(nèi)向電流;選用從-70 mV到0 mV，持續(xù)時(shí)間為30 ms的去極化Step脈沖刺激海馬神經(jīng)元，誘發(fā)出一種在去極化瞬間瞬時(shí)激活達(dá)到峰值并迅速失活的內(nèi)向

39、流，這兩種內(nèi)向電流均能被1μM TTX完全阻斷，表明所誘發(fā)的內(nèi)向電流分別為INaP和INat。
　　 各處理組對(duì)INaP的抑制作用有顯著差異(F=4090.738，P＜0.001)。與Control組相比較，0.1μM、0.3μM、0.5μM、1μM、2μM和4μM濃度的SSa均能夠顯著增加INaP抑制率，抑制率分別為3.483±0.097％、6.722±0.186％、21.284±2.012％、58.104±1.546％、70

40、.546±0.991％、72.504±0.991％，P值均＜0.001，不同濃度的SSa對(duì)INaP的抑制作用不同，在一定濃度范圍內(nèi)SSa對(duì)INaP的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，半數(shù)有效抑制量為0.84μM。各處理組對(duì)INat的抑制作用有顯著性差異(F=3342.278，P＜0.001)。而與Control組相比較，各濃度的SSa對(duì)INat均無(wú)顯著影響，P值均為1.000。表明SSa對(duì)INaP有選擇性的抑制作用。
　　 9.SSa對(duì)大

41、鼠海馬腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)元ITotal、IK和IA大小的調(diào)節(jié)作用
　　 將細(xì)胞膜電位鉗制至-50 mV，后給予一持續(xù)時(shí)間為300 ms，-120 mV的超極化電壓脈沖，緊接之后是一從-60 mV到+60 mV，步階為+10mV，持續(xù)時(shí)間為400 ms的去極化Step脈沖刺激，誘發(fā)出一外向K+通道電流即ITotal，選用一持續(xù)時(shí)間為200 ms，-120 mV的超極化電壓預(yù)脈沖，緊接之后是去極化至-40 mV，持續(xù)時(shí)間為100

42、ms的預(yù)脈沖，之后是從-60 mV到+60 mV，步階為+10 mV，持續(xù)時(shí)間為400 ms的去極化Step脈沖刺激，誘發(fā)出一持續(xù)性外向K+通道電流成分即IK，運(yùn)用Clampfit10.0軟件將得到的ITotal和IK相減得到瞬時(shí)外向K+通道電流成分即IA。
　　 將用藥前后ITotal、IK和IA的電流峰值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析表明，1μMSSa能夠顯著升高ITotal和IA電流幅度(t=-23.975，P＜0.001;t=

43、-10.281，P＜0.001)，而用藥前后IK電流幅度無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=-1.543，P=0.157）。
　　 10.SSa對(duì)大鼠海馬腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)元ITotal、IK和IA激活特性的調(diào)節(jié)作用
　　 將ITotal、IK和IA的刺激電壓(V)和誘發(fā)出的相應(yīng)電流值(I)運(yùn)用Clampfit10.0軟件繪制I-V曲線，隨著刺激電壓的去極化，SSa對(duì)ITotal和IA電流的增強(qiáng)作用逐漸增大，而SSa對(duì)IK的I-V曲

44、線無(wú)明顯影響。繪制三種電流的激活曲線，用藥前后相比較，1μM SSa能夠使IA的激活曲線超極化相移位，顯著下調(diào)V1/2(28.583±0.588 vs.22.317±0.662 mV，t=36.729，P＜0.001)，對(duì)k值無(wú)顯著影響(21.933±1.472 vs.23.617±1.592，t=-2.139，P=0.085);對(duì)ITotal激活曲線的V1/2和k均無(wú)顯著性影響（V1/2:32.467±0.432 vs.31.700±

45、1.014 mV，t=2.43，P=0.059;k:33.483±1.057 vs.32.867±1.648，t=2.116，P=0.088）;對(duì)IK的激活曲線的V1/2和k也無(wú)顯著性調(diào)節(jié)作用(V1/2:28.350±1.058 vs.28.450±1.810 mV，t=-0.249，P=0.813;k:30.233±0.942 vs.31.233±0.977，t=-2.421，P=0.06)。
　　 11.SSa對(duì)大鼠海馬腦片

46、CA1區(qū)錐體神經(jīng)元IA失活特性的調(diào)節(jié)作用
　　 進(jìn)一步觀察SSa對(duì)IA失活特性的調(diào)節(jié)作用，將細(xì)胞膜電位鉗制至-50 mV，給予一持續(xù)時(shí)間為120ms從-90 mV到+10mV步階為+10mV的預(yù)脈沖，之后是去極化至+50 mV，持續(xù)時(shí)間為80 ms的單脈沖刺激誘發(fā)IA失活電流。繪制IA失活曲線，用藥前后相比較，1μM SSa能夠使IA的失活曲線去極化相移位，能顯著上調(diào)IA失活曲線的V1/2(t=-82.750，P＜0.001)，

47、而對(duì)IA失活曲線的k值無(wú)顯著影響(t=-2.436，P=0.059)。
　　 12.SSa對(duì)大鼠海馬腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)元4AP敏感及TEA敏感K+通道電流的調(diào)節(jié)作用
　　 選用20 mM TEA和4 mM4AP，從藥理學(xué)角度分離TEA敏感的外向性K+通道電流成分和4AP敏感的外向性K+通道電流成分，并觀察SSa對(duì)這兩種藥物敏感的K+通道電流的調(diào)節(jié)作用。20 mM TEA作用后總外向性K+通道電流的持續(xù)成分減少，僅?？焖?/p>

48、激活-失活成分，即4AP敏感K+通道電流，1μM SSa能夠顯著上調(diào)這種外向性快K+通道電流成分（t=-20.457，P＜0.001）;4 mM4AP作用后總外向性K+通道電流的快速激活-失活成分被阻斷，僅剩一持續(xù)性外向性K+通道電流成分，即TEA敏感K+通道電流，1μM SSa對(duì)這種持續(xù)性外向性K+通道電流成分無(wú)顯著調(diào)節(jié)作用（t=-2.329，P=0.053）。表明SSa對(duì)4AP敏感K+通道電流有選擇性增加作用。
　　 四、結(jié)

49、論:
　　 1.SSa能夠顯著抑制無(wú)鎂外液誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元SREDs樣放電及SEs樣放電，這種抑制作用是可逆的，在一定劑量范圍內(nèi)，呈現(xiàn)濃度依賴性。在SREDs樣放電模型中，1μM SSa的抑制作用與常規(guī)劑量苯妥英的抑制作用相當(dāng);SEs樣放電模型對(duì)多種臨床常用抗癲癇藥表現(xiàn)耐藥性，而0.1μM濃度的SSa即可顯著抑制SEs樣放電，常規(guī)劑量及高劑量的苯妥英均對(duì)SEs無(wú)抑制作用，提示SSa可能對(duì)難治性癲癇有良好的治療潛力。<

50、br>　　 2.SSa能夠顯著抑制4AP誘導(dǎo)的大鼠內(nèi)嗅皮層-海馬腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)元癲癇樣放電，這種抑制作用是可逆的，在一定劑量范圍內(nèi)，呈現(xiàn)濃度依賴性。抑制作用優(yōu)于VPA，提示SSa有良好的抗癲癇作用。
　　 3.SSa能夠抑制NMDA誘發(fā)的海馬神經(jīng)元NMDAR電流幅度，抑制Na+通道電流幅度，上調(diào)K+通道電流幅度，說(shuō)明SSa可以通過(guò)多位點(diǎn)調(diào)節(jié)發(fā)揮抗癲癇作用，不僅對(duì)興奮性配體依賴性離子通道有調(diào)節(jié)作用，對(duì)電壓依賴性離子通道也有