AMPK在胃癌中對(duì)Bmi-1的抑制作用.pdf

1、背景和目的：
　　5’單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）一直以來被稱為細(xì)胞內(nèi)的“能量感受器與調(diào)節(jié)器”，AMPK的抑癌功能已經(jīng)得到研究者們的廣泛認(rèn)可。AMPK可通過一系列信號(hào)通路影響細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移從而發(fā)揮其抑癌功能。Bmi-1屬于多疏基因家族成員，不僅能維持腫瘤干細(xì)胞的自我更新，還在EMT進(jìn)程中發(fā)揮著極為重要的作用。我們?cè)诜伟┑那捌谠囼?yàn)表明：1. AMPK活性升高，B

2、mi-1表達(dá)下降；而降低AMPK活性后，Bmi-1的表達(dá)反而升高，即AMPK能夠抑制Bmi-1的表達(dá)。2. LITAF為AMPK下游，受AMPK正調(diào)控，且我們的microarray分析結(jié)果顯示LITAF可以調(diào)控部分miRNA，而其中的miRNA-15a/128/194可調(diào)控Bmi-1的表達(dá)。所以我們猜想AMPK是否能通過LITAF抑制Bmi-1的表達(dá)。因此，本研究旨在探究胃癌中Bmi-1的表達(dá)是否受AMPK抑制，并探索AMPK影響B(tài)mi

3、-1表達(dá)的分子機(jī)制。為進(jìn)一步研究AMPK的抑癌功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1收集66例胃癌及相應(yīng)癌旁組織蠟塊，組織切片后采用免疫組化方法檢測(cè)p-AMPK、Bmi-1在胃癌及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本中的表達(dá)情況，并分析兩者之間的相關(guān)性。
　　2收集16例胃腺癌及相應(yīng)癌旁新鮮組織，提取蛋白后采用Western blotting方法檢測(cè)p-AMPK、Bmi-1在胃癌及其癌旁新鮮組織標(biāo)本中的表達(dá)情況。
　　3用AMPK激

4、活劑黃連素、二甲雙胍和AMPK抑制劑Compound C分別處理胃癌細(xì)胞SGC-7901和AGS后，觀察AMPK的活性變化情況、以及LITAF和Bmi-1蛋白的表達(dá)變化。
　　4轉(zhuǎn)染AMPK-DN質(zhì)粒至AGS細(xì)胞抑制AMPK的活性，觀察Bmi-1表達(dá)的變化。
　　5制備含pSuperRetro-LITAF-shRNA和pSuperRetro-LITAF-shRNA-Control重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒，感染胃癌細(xì)胞AGS敲除LI

5、TAF基因，puromycin篩選獲得AGS-LITAF-shRNA和AGS-shRNA-C穩(wěn)定細(xì)胞株。采用Western Blotting及qRT-PCR兩種方法驗(yàn)證LITAF缺失細(xì)胞株是否構(gòu)建成功，并檢測(cè)Bmi-1蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1在胃癌組織中Bmi-1的表達(dá)明顯高于相應(yīng)的癌旁組織（P＜0.01），而p-AMPK在胃癌組織中的表達(dá)則顯著低于相應(yīng)的癌旁組織（P＜0.01）。
　　2 Berberine處

6、理SGC-7901和AGS細(xì)胞后，AMPK活性升高，p-ACC表達(dá)增加，而Bmi-1蛋白的表達(dá)降低。相反，用AMPK抑制劑Compound C抑制了AMPK活性并增加了Bmi-1的表達(dá)。提示AMPK可能調(diào)節(jié)Bmi-1的表達(dá)。
　　3轉(zhuǎn)染AMPK-DN質(zhì)粒至AGS細(xì)胞中，AMPK下游因子活性下降，但Bmi-1表達(dá)增加。通過以上研究我們可以確定AMPK能夠抑制Bmi-1的表達(dá)。
　　4 Metformin能夠增加AMPK活性，增

7、加LITAF的表達(dá)，并減少Bmi-1的表達(dá)。
　　5與AGS-shRNA-C細(xì)胞克隆株相比，AGS-LITAF-shRNA單克隆細(xì)胞株中LITAF蛋白表達(dá)量明顯減少，而Bmi-1的表達(dá)顯著增高。結(jié)果表明LITAF能夠調(diào)節(jié)Bmi-1的表達(dá)。因此，AMPK能夠通過AMPK-LITAF-Bmi-1信號(hào)軸發(fā)揮對(duì)Bmi-1的抑制作用。
　　結(jié)論：
　　在胃癌細(xì)胞中，AMPK能抑制Bmi-1蛋白的表達(dá)，這種抑制作用是通過上調(diào)LIT