BMI-1在骨肉瘤中的表達(dá)及功能研究.pdf

1、骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，來(lái)源于間葉組織，可發(fā)生于任何年齡，尤其好發(fā)于青少年，預(yù)后差。骨肉瘤惡性程度及轉(zhuǎn)移率高，其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是大多數(shù)骨肉瘤患者治療失敗和死亡的最主要原因。從目前情況來(lái)看，雖然5年生存率已經(jīng)達(dá)到65-75％，但在診斷、治療和預(yù)后等方面仍存在不足。為此，發(fā)現(xiàn)并建立新的、有效的骨肉瘤的診治措施勢(shì)在必行，探索早期診斷、預(yù)后評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)和開發(fā)新的治療藥物（非化療藥）是當(dāng)前骨肉瘤臨床診治中熱門的研究方向。文獻(xiàn)表明，BMI-1基因在

2、腫瘤方面的研究證據(jù)非常豐富。但目前國(guó)內(nèi)、外對(duì)于該基因與骨腫瘤的相關(guān)性研究卻較為缺乏，因此我們將研究重點(diǎn)鎖定在BMI-1與骨肉瘤之間的相關(guān)性研究上。
　　 目的：構(gòu)建人BMI-1基因相關(guān)shRNA慢病毒載體，包裝成病毒顆粒后感染骨肉瘤細(xì)胞株后，觀察抑制BMI-1表達(dá)水平對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力、細(xì)胞周期以及對(duì)化療藥物敏感性的影響。并通過(guò)回顧性研究探討B(tài)MI-1在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)及其與臨床病理及預(yù)后的關(guān)系。
　　 方法：用

3、慢病毒介導(dǎo)的BMI-1shRNA轉(zhuǎn)染入骨肉瘤細(xì)胞株SAOS-2和U20S，并通過(guò)Real-timePCR和WesternBlot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后BMI-1的表達(dá)情況。運(yùn)用MMT實(shí)驗(yàn)、PI-FACS實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)、Tanswell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、流式雙染實(shí)驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)染后的人骨肉瘤細(xì)胞株的惡性表型進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)對(duì)北京協(xié)和醫(yī)院的16例骨肉瘤、9例軟骨肉瘤、11例骨軟骨瘤、2例尤文氏肉瘤進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，臨床驗(yàn)證BMI-1與骨肉瘤的關(guān)系。
　　

4、 結(jié)果：慢病毒介導(dǎo)的RNAi持續(xù)的、顯著的降低了BMI—1表達(dá)。在體外實(shí)驗(yàn)中，下調(diào)BMI-1表達(dá)顯著影響了人骨肉瘤細(xì)胞的惡性表型，降低了增殖能力、侵襲能力，增加了對(duì)于順鉑化療的敏感性，但對(duì)于細(xì)胞周期無(wú)顯著性影響，并通過(guò)回復(fù)對(duì)照實(shí)驗(yàn)證實(shí)該基因的特異性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)BMI-1RNAi對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲抑制作用及增加腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑化療敏感性具有一定的細(xì)胞特異性。臨床病例研究證實(shí)BMI-1存在于骨肉瘤(12/16)、骨軟骨瘤(1/11)，軟骨肉

5、瘤(6/9)、尤文氏肉瘤(1/2)中，但在非腫瘤骨組織中沒(méi)有表達(dá)(0/10)。骨肉瘤中BMI-1陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于骨軟骨瘤及非腫瘤骨組織(P<0.05)。惡性骨腫瘤中BMI-1陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于良性骨腫瘤(P<0.05)。BMI-1陽(yáng)性表達(dá)情況與骨肉瘤病例組臨床病理特點(diǎn)無(wú)顯著性關(guān)聯(lián)。在單因素生存分析中，除術(shù)前是否轉(zhuǎn)移與病例生存期存在顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05)外，余項(xiàng)目均無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。在Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型中，所有結(jié)果均無(wú)顯著性。但根據(jù)相對(duì)

6、危險(xiǎn)度來(lái)看，病理分級(jí)、Enneking外科分期、術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、BMI-1表達(dá)情況四項(xiàng)對(duì)于骨肉瘤病人的預(yù)后存在一定影響。
　　 結(jié)論：構(gòu)建了干擾BMI-1的慢病毒體系，感染入骨肉瘤細(xì)胞系SAOS-2和U20S，經(jīng)Real-timePCR以及WesternBlot檢測(cè)，能有效干擾BMI-1的表達(dá)，為骨肉瘤細(xì)胞功能研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：干擾BMI-1后能顯著抑制人骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力，并提高其對(duì)于

7、順鉑的敏感性，提示BMI-1在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中作用顯著，為骨肉瘤分子靶向治療開辟了一個(gè)嶄新的方向，其很可能成為骨肉瘤分子治療的靶點(diǎn)之一。
　　 運(yùn)用免疫組化方法證實(shí)了BMI-1蛋白在骨腫瘤組織（包括骨軟骨瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤）中的表達(dá)，并且證明BMI-1蛋白在惡性骨腫瘤中的表達(dá)率明顯高于良性骨腫瘤。研究提示BMI-1很可能會(huì)成為骨肉瘤等惡性骨腫瘤的診斷指標(biāo)之一。
　　 BMI-1基因的表達(dá)與臨床分期、病理分

8、級(jí)、年齡、性別、腫瘤部位、術(shù)前轉(zhuǎn)移、軟組織浸潤(rùn)等因素?zé)o顯著性關(guān)聯(lián)。研究提示需進(jìn)一步研究證實(shí)，更深層次挖掘BMl-l與骨肉瘤患者臨床病理特點(diǎn)的相關(guān)性及規(guī)律。
　　 骨肉瘤病人生存因素分析提示病人術(shù)后生存期與術(shù)前是否轉(zhuǎn)移存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Cox回歸模型提示病理分級(jí)、Enneking外科分期、術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、BMI-1表達(dá)情況四項(xiàng)對(duì)于骨肉瘤病人的生存期存在一定影響。研究提示需要進(jìn)一步研究來(lái)分析骨肉瘤患者的預(yù)后影響因素，并驗(yàn)證BMI-1是否