孕酮對(duì)P2X-,3-受體介導(dǎo)的外周痛覺(jué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的快速抑制作用.pdf

1、疼痛是人體各部分受到損傷性刺激引起的不愉快的感覺(jué)，它提供軀體受到威脅的警報(bào)信號(hào)，是生命不可缺少的一種特殊保護(hù)功能。但另一方面，嚴(yán)重的慢性疼痛困擾著數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的人們，是臨床的一大難題。因而了解疼痛產(chǎn)生的機(jī)制，尋找解除疼痛的方法，是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。臨床觀察早就注意到疼痛有明顯的性別差異，主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：1)腸激惹綜合征、間質(zhì)性膀胱炎、顳下頜關(guān)節(jié)炎等病癥多見(jiàn)于女性；2)這些疾病癥發(fā)生和發(fā)展與月經(jīng)周期相關(guān)。這些證據(jù)表明性激素可能參與

2、痛覺(jué)的調(diào)節(jié)。 傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為孕酮(progesterone，PROG)主要由卵巢和胎盤產(chǎn)生，與雌激素共同維持女性的生理周期和生理特征，然而越來(lái)越多的研究表明，孕酮除了參與生殖功能外，還可以在神經(jīng)系統(tǒng)中合成和分泌，從而影響神經(jīng)系統(tǒng)的功能，是神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的信號(hào)分子。近年來(lái)臨床、流行病學(xué)及實(shí)驗(yàn)室研究均發(fā)現(xiàn)疼痛存在性別差異，除了與雌激素水平緊密相關(guān)外，還與兩性體內(nèi)孕酮水平的差異有關(guān)聯(lián)，因而孕酮及其受體在疼痛調(diào)節(jié)中的可能作用及機(jī)制正日

3、益受到更多地關(guān)注。 孕激素是一種脂溶性激素，它可以通過(guò)激活靶細(xì)胞核內(nèi)受體(即PRA和PRB)，影響靶基因轉(zhuǎn)錄。這種作用往往牽涉到新蛋白的合成，需要較長(zhǎng)的潛伏期，稱為激素的基因組作用。另一方面，孕激素還可以作用于可能存在于細(xì)胞膜上的受體，介導(dǎo)快速效應(yīng)，稱為激素的非基因組作用。目前已發(fā)現(xiàn)，孕酮受體廣泛分布于DRG初級(jí)傳入神經(jīng)元和外周組織細(xì)胞，提示孕激素可能影響感覺(jué)信號(hào)在傳入神經(jīng)末梢的轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。 ATP不僅是一種貯能、供能物

4、質(zhì)，還是一種細(xì)胞間信息傳遞物質(zhì)，通過(guò)激活P2X(配基門控性非選擇性陽(yáng)離子通道)受體而產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。大量的研究證明，ATP參與痛覺(jué)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與傳遞，表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：1)傷害性刺激可以使組織細(xì)胞釋放ATP；2)外源性ATP可通過(guò)激活P2X受體而引起痛覺(jué)；3)P2X受體廣泛分布于感覺(jué)神經(jīng)末梢和有關(guān)中樞傳導(dǎo)通路；4)在P2X2和P2X3基因敲除小鼠，炎癥性軀體痛覺(jué)明顯低于對(duì)照小鼠，表明ATP是炎癥性痛覺(jué)的重要介質(zhì)。背根神經(jīng)節(jié)(DRG

5、)的初級(jí)感覺(jué)傳入神經(jīng)元是研究痛覺(jué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的重要模型之一。在生理?xiàng)l件下，DRG神經(jīng)元上的P2X3受體特異性地參與痛覺(jué)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。而在炎性痛和神經(jīng)損傷性痛的形成過(guò)程中，ATP及P2X3受體也起到起重要的作用。這些都說(shuō)明ATP和P2X3受體是外周痛覺(jué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和傳遞中的重要成員。 因而在本課題中，我們運(yùn)用動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)、全細(xì)胞膜片鉗及分子生物學(xué)等方法，從整體、細(xì)胞和受體分子水平研究孕激素對(duì)ATP介導(dǎo)的外周痛覺(jué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用。重點(diǎn)

6、探討正常條件下孕激素對(duì)初級(jí)感覺(jué)傳入神經(jīng)元上P2X3受體的功能影響，對(duì)于闡明疼痛的性別相關(guān)性，以及將來(lái)研制新一代的鎮(zhèn)痛劑，具有重要的意義。 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃头椒?1.動(dòng)物分組 48只SD雌性大鼠購(gòu)自上海西普兒-必凱公司，大鼠隨機(jī)分為四組(n=12)，進(jìn)行藥物皮下注射，分別為：生理鹽水組、孕酮組、RU38486組及孕酮+RU38486組，觀察各組大鼠的基礎(chǔ)痛閾。因個(gè)別大鼠一般狀況較差，每組挑出11只進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

7、 2.痛閾測(cè)定 將測(cè)試大鼠置于特制籠中，熟悉環(huán)境30min后，給四組大鼠分別皮下注射生理鹽水、孕酮(500μg)、RU38486(20μg)及孕酮(500μg)+RU38486(20μg)30 min后，再以弗萊毛刺激大鼠后足部，以大鼠抬起后肢為反應(yīng)陽(yáng)性。弗萊毛的力量分別為：1(0.0229 g)、2(0.494 g)、3(2.05 g)、4(4.01 g)、5(6 g)、6(8 g)、7(10.8 g)、8(12.2 g)

8、、9(14.9 g)。從細(xì)到粗，每個(gè)力量的弗萊毛刺激左腳和右腳各一次，以大鼠抬起后肢為反應(yīng)陽(yáng)性。 3.RT-PCR測(cè)定 (1)RNA分離和cDNA合成 大鼠斷頭致死后，迅速取出8對(duì)腰骶段DRG(L1-S2)，用Trizol提取液提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)RNA純度(A260/280)，同時(shí)行RNA定量。提取的RNA中，每樣本取2μg在20μl體系中反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存，用于實(shí)時(shí)定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)擴(kuò)增孕

9、酮受體基因. (2)RT-PCR 用于擴(kuò)增mPRa基因的引物對(duì)為：CTGGAAGCCGTACATCTATGC(正義)，GAAGCTGTAATGCCAGAACTC(反義)；反應(yīng)條件為：95℃，3min，95℃，35s；62℃，10s；72℃，10s。用于擴(kuò)增mPRβ基因的引物對(duì)為：AAGAAGGCCAGCCCTGCTGGTAC(正義)；TTTGTGGAGGCAGGGGCATT(反義)，反應(yīng)條件為：95℃，3min，95℃，

10、35s；62℃，10s；72℃，10s。用于擴(kuò)增PMRγ，基因的引物對(duì)為：AGTTCCGCCACTGCCTGCAT(正義)CCGGGGCTTCTGGAGTTCAA(反義)，反應(yīng)條件為：95℃，3min，95℃，35s；62℃，10s；72℃，10s。 4.大鼠DRG分離培養(yǎng)細(xì)胞的全細(xì)胞膜片鉗記錄 將酶解得到的DRG分離細(xì)胞置入記錄小室，并以1ml/min的速度用細(xì)胞外液灌流。常溫下進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄，所用儀器為Axop

11、atch200B放大器。鉗制電壓為-60mV。記錄膜電流應(yīng)用低通濾波(10KHz，-3dB)。數(shù)據(jù)用pClamp9.0記錄并處理。用EXCEL進(jìn)行t檢驗(yàn)。原始圖用Clampfit(pCLAMP software)記錄并用Origin7繪圖。所有的藥物稀釋后通過(guò)ALA-VM8灌流系統(tǒng)給予，其中一管給予正常Kreb’s液，用來(lái)快速終止給藥。激動(dòng)劑每次給予4s，間隔2min。灌流用外液成分(mmol/L)：NaCl154.KCl4.7，MgC

12、l21.2，CaCl22.5，Hepes10及glucose5.6；用NaOH將pH值調(diào)成7.4。記錄電極電阻2～5MQ。所充電極內(nèi)液成分為(mmol/L)：KCI120，HEPES10，tripotassiumcitrate10和EGTA10；用KOH將pH值調(diào)成7.2。 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.四組大鼠分別皮下給予生理鹽水、孕酮(500μg)、RU38486(20μg)及孕酮(500μg)+RU38486(20μg)30m

13、in后用弗萊毛測(cè)大鼠后肢的疼痛反應(yīng)，繼續(xù)觀察至60分鐘，發(fā)現(xiàn)孕酮明顯提高大鼠后肢外周機(jī)械痛閾，RU38486可以逆轉(zhuǎn)孕酮這一作用。 2.RT-PCR結(jié)果顯示，大鼠DRG中孕酮的膜受體mPRα、mPRβ及mPRγ mRNA均有表達(dá)，片段長(zhǎng)度分別為：289，379和440 bp。 3.通過(guò)全細(xì)胞膜片鉗的方法，發(fā)現(xiàn)在大鼠DRG神經(jīng)元上孕酮(10 pm/L-1μm/L)對(duì)P2X3受體介導(dǎo)電流有快速抑制作用，且呈劑量依賴關(guān)系。孕酮

14、受體阻斷劑RU38486(1μm/L-100μm/L)可以逆轉(zhuǎn)孕酮的這種抑制作用，提示孕酮的這一抑制作用有其受體參與。 4.蛋白激酶阻斷劑H-9(100μmol/L)可完全阻斷孕酮的抑制作用。提示蛋白激酶參與了孕酮的抑制作用。 5.PKA阻斷劑KT5720(1μmol/L)可部分阻斷孕酮的這種抑制作用。PKA激動(dòng)劑forskolin(1μmol/L)可以模擬孕酮的這種抑制作用。這表明cAMP-PKA途徑可能均參與了孕酮的

15、抑制作用。 6.PKC阻斷劑G(o)6976(1μmol/L)、IP3阻斷劑LY294，002(1μmol/L)及PLC阻斷劑U73122(1μmol/L)時(shí)，均可部分阻斷孕酮的這種抑制作用。同時(shí)，PKC激動(dòng)劑PMA(1μmol/L)可以模擬孕酮的這種抑制作用。這表明PLC-IP3-PKC這一途徑可能參與了孕酮的抑制作用。 7.當(dāng)同時(shí)給予PKA阻斷劑KT5720(1μmol/L)和PKC阻斷劑G(o)6976(1μmol

16、/L)時(shí)，孕酮對(duì)P2X3電流的抑制作用完全被阻斷，提示cAMP-PKA和PLC-PKC途徑可能是孕酮調(diào)節(jié)P2X3受體功能的主要下游途徑。 三、結(jié)論 1、孕酮可能通過(guò)作用于孕酮受體，快速抑制外周機(jī)械傷害性感受的形成。 2、孕酮膜受體mPRα、mPRβ及mPRγ在DRG上均有表達(dá)，提示孕酮膜受體可能參與了外周痛覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)。 3、在分離培養(yǎng)的DRG細(xì)胞上，孕酮可以快速抑制P2X3受體介導(dǎo)的電流，這一作用可能通過(guò)孕酮