SHP2在小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：肺癌(LC)在所有惡性腫瘤相關(guān)死亡原因中位居首位。小細(xì)胞肺癌（SCLC）是肺癌中預(yù)后最差的類型,在LC中占14-20％的比例。其生長(zhǎng)速度快，轉(zhuǎn)移早，預(yù)后差。即使經(jīng)歷正規(guī)放化療，SCLC患者中位生存期僅為8-13個(gè)月。順鉑耐藥導(dǎo)致的治療效果不佳是SCLC患者生存率不高的重要原因。因此，積極探討SCLC耐藥的具體機(jī)制對(duì)改善SCLC預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義。
　　順鉑（CDDP），為一種最常用的細(xì)胞毒類化療藥物。絕大部分小細(xì)胞

2、肺癌患者均采用以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合治療方案。然而，暴露于順鉑的惡性細(xì)胞可能激活自身適應(yīng)性反應(yīng)來(lái)抵抗順鉑的抗增殖/細(xì)胞毒作用，并最終產(chǎn)生對(duì)順鉑的耐藥性，使患者對(duì)以順鉑為基礎(chǔ)的化療反應(yīng)不佳。PI3K/AKT通路是生理功能必需的信號(hào)傳導(dǎo)通路，其信號(hào)軸可提供強(qiáng)大的促生存因子。因此，AKT通路可能在腫瘤順鉑靶下耐藥中扮演了重要的角色。但其詳細(xì)作用的機(jī)制及其在順鉑耐藥中的重要程度尚不很清楚。
　　SHP2是一種在人體多種組織中廣泛表達(dá)的非受體蛋

3、白酪氨酸磷酸酶（PTP）。它在多種細(xì)胞事件過(guò)程如細(xì)胞增殖、存活、遷移中起著關(guān)鍵作用。對(duì) SHP2突變或異常表達(dá)與血液惡性腫瘤及多個(gè)實(shí)體瘤有關(guān)。SHP2可以以連接蛋白的功能結(jié)合PI3K的P85亞基及相關(guān)激活促進(jìn)因子，導(dǎo)致PI3K活化。SHP2也能通過(guò)PTP催化活性依賴的方式，激活PI3K/Akt信號(hào)。但SHP2激活PI3K/ Akt的效應(yīng)研究主要集中在腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移方面，它在腫瘤耐藥中的作用還未得到充分認(rèn)識(shí)。前期發(fā)現(xiàn) SHP2在化療耐藥的

4、肺癌細(xì)胞中高表達(dá)，提示它可能參與了肺癌化療耐藥過(guò)程。
　　CA916798是前期通過(guò)消減抑制雜交（ SSH）在肺癌多藥耐藥細(xì)胞株SPC-A-1/CDDP中發(fā)現(xiàn)的耐藥相關(guān)蛋白。其與目前已知蛋白無(wú)同源性。CA916798的結(jié)構(gòu)中有多個(gè)絲/蘇氨酸激酶及酪氨酸激酶激活位點(diǎn)，表明它可被相關(guān)激酶激活，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。研究表明，CA916798對(duì)肺腫瘤細(xì)胞順鉑敏感性下降起促進(jìn)作用，且可被PI3K/AKT通路調(diào)節(jié)。
　　基于以上研究推測(cè)：

5、SHP2可通過(guò)PI3K/AKT通路調(diào)節(jié)CA916798的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致SCLC對(duì)順鉑耐藥。本研究即為證實(shí)以上推測(cè)而進(jìn)行。
　　材料與方法：本研究分為體外實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)試驗(yàn)和臨床檢測(cè)分析三大部分。
　　1.以順鉑敏感的親代小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446及在采用順鉑誘導(dǎo)親代細(xì)胞建立的耐藥細(xì)胞株H446/CDDP為研究對(duì)象。
　　2.將 SHP2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染親代細(xì)胞 H446， SHP2 ShRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染耐藥細(xì)胞H446/CDDP，

6、并篩選出穩(wěn)定高/低表達(dá)SHP2的細(xì)胞株。
　　3.在干預(yù)SHP2的同時(shí)，轉(zhuǎn)染AKT持續(xù)表達(dá)質(zhì)粒或AKT RNA干擾質(zhì)粒，觀察在不同AKT表達(dá)水平的情況下，SHP2誘導(dǎo)的SCLC順鉑耐藥程度是否有所改變。
　　4.采用CCK8法檢測(cè)各細(xì)胞株對(duì)順鉑敏感程度。
　　5.免疫共沉淀檢測(cè)與SHP2相互結(jié)合的蛋白。
　　6. Western-blotting檢測(cè)各蛋白表達(dá)水平。
　　7. Real-time PCR測(cè)定

7、相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)量。
　　8.將上述各細(xì)胞株皮下注射入裸鼠體內(nèi)，建立裸鼠移植瘤模型。
　　9.順鉑或生理鹽水腹腔注射對(duì)裸鼠移植瘤進(jìn)行處理，通過(guò)觀察各組裸鼠移植瘤體積的變化，判斷各組細(xì)胞對(duì)順鉑治療的敏感程度。
　　10.篩選經(jīng)化療4-6周期的小細(xì)胞肺癌病人，收集數(shù)據(jù)，并取腫瘤組織進(jìn)行HE及免疫組化染色，檢測(cè) SHP2及 CA916798蛋白表達(dá)的相關(guān)性，同時(shí)比較不同蛋白表達(dá)水平的患者在化療后生存時(shí)間有無(wú)差異。

8、　　結(jié)果：
　　1. SHP2在SCLC順鉑耐藥中的作用
　?。?）對(duì)實(shí)驗(yàn)所用順鉑敏感的H446細(xì)胞及對(duì)順鉑耐藥的H446/CDDP細(xì)胞進(jìn)行鑒定，神經(jīng)特異性烯醇化酶（NSE）免疫熒光顯示H446及H446/CDDP均有NSE表達(dá)，證實(shí)所用細(xì)胞確為小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系。
　?。?）H446細(xì)胞順鉑 IC50值為2.493ug/ml，H446/CDDP細(xì)胞順鉑 IC50值為15.239ug/ml。H446/CDDP的耐藥指數(shù)為

9、6.1127（vs. H446）。與未經(jīng)干預(yù)的H446細(xì)胞比較，H446/CDDP能耐受更高濃度的順鉑。
　?。?）Western-blotting結(jié)果顯示，與H446細(xì)胞比較， H446/CDDP中SHP2表達(dá)量明顯上升。
　?。?）將SHP2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H446細(xì)胞并進(jìn)行篩選，建立持續(xù)表達(dá)高水平量SHP2的H446-SHP2細(xì)胞株；將SHP2 ShRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染順鉑耐藥細(xì)胞H446/CDDP并進(jìn)行篩選，建立持續(xù)表達(dá)低水平

10、量SHP2的H446/CDDP-shSHP2細(xì)胞株。H446-SHP2與H446比較，SHP2表達(dá)量升高；H446/CDDP-shSHP2與H446/CDDP比較，SHP2表達(dá)量降低，提示對(duì)SHP2的表達(dá)干預(yù)成功。
　　（5）半定量測(cè)定結(jié)果表明各細(xì)胞株SHP2 mRNA表達(dá)水平與蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)趨勢(shì)，但這種相關(guān)趨勢(shì)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?。?）總磷酸酶活性檢測(cè)顯示：各細(xì)胞株總磷酸酶活性亦有與蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)趨勢(shì)，但差異仍

11、未有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　（7）H446順鉑IC50值為5.14ug/ml，H446-SHP2順鉑IC50值為10.414 ug/ml。H446-SHP2耐藥指數(shù)為2.03（vs. H446）。H446/CDDP順鉑IC50值為13.351 ug/ml， H446/CDDP-shSHP2順鉑 IC50值為6.621ug/ml，H446/CDDP-shSHP2的耐藥指數(shù)為0.4959（vs. H446/CDDP）。在對(duì)順鉑敏感的H446

12、細(xì)胞株中，高表達(dá)SHP2可使H446細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥；在對(duì)順鉑耐受的H446/CDDP細(xì)胞株中，部分抑制SHP2表達(dá)可使順鉑耐藥的細(xì)胞株H446/CDDP部分恢復(fù)對(duì)順鉑的敏感性。
　　2. SHP2促進(jìn)SCLC順鉑耐藥的機(jī)制
　　（1）在H446及H446/CDDP細(xì)胞內(nèi)，SHP2與PI3K p85亞基及CA916798均可結(jié)合。在總 SHP2量大致相同的情況下，H446/CDDP細(xì)胞與 H446細(xì)胞比較，SHP2結(jié)合的p85

13、及CA916798的量更多。加入順鉑后與加入順鉑前比較，SHP2結(jié)合的p85及CA916798的量也有所增加。
　?。?）H446細(xì)胞高表達(dá)SHP2后， AKT、pAKT、pmTOR及CA916798蛋白表達(dá)隨之增高。在順鉑耐藥的H446/CDDP細(xì)胞，部分抑制SHP2蛋白表達(dá)后，下游 AKT、pAKT、pmTOR、CA916798蛋白表達(dá)隨之降低。這提示 SHP2表達(dá)量的變化可影響下游AKT通路相關(guān)蛋白的活性及CA916798表

14、達(dá)量的變化。
　?。?）與轉(zhuǎn)入空載體比較，H446細(xì)胞在轉(zhuǎn)染AKT RNA干擾質(zhì)粒后，AKT蛋白表達(dá)水平下降；轉(zhuǎn)染AKT表達(dá)質(zhì)粒后，AKT蛋白表達(dá)水平升高。說(shuō)明相關(guān)質(zhì)粒可有效干預(yù)AKT的表達(dá)。
　　（4）在高表達(dá)SHP2的H446細(xì)胞中部分抑制AKT表達(dá)，可使增高的CA916798表達(dá)量降低。在低表達(dá) SHP2的 H446細(xì)胞中高表達(dá) AKT可使降低的CA916798恢復(fù)到一個(gè)比較高的水平。說(shuō)明SHP2可通過(guò)AKT調(diào)控CA9

15、16798表達(dá)量變化。
　　（5）H446細(xì)胞順鉑IC50值為4.82ug/ml，H446-SHP2順鉑IC50值為10.902ug/ml， H446-SHP2-siAKT順鉑IC50值為6.236ug/ml。上述結(jié)果表明：在持續(xù)表達(dá)高水平SHP2的H446-SHP2細(xì)胞中部分抑制AKT，可使耐藥性增高的H446-SHP2細(xì)胞部分恢復(fù)對(duì)順鉑的敏感性。H446/CDDP順鉑IC50值為11.032ug/ml，H446/CDDP-sh

16、SHP2順鉑IC50值為5.983ug/ml，H446/CDDP-shSHP2-AKT順鉑 IC50值為9.344ug/ml。上述結(jié)果表明：在部分抑制SHP2的H446/CDDP細(xì)胞中高表達(dá)AKT，可使本來(lái)對(duì)順鉑耐藥性下降的H446/CDDP-shSHP2細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性又恢復(fù)到比較高的水平。對(duì)AKT表達(dá)水平進(jìn)行干預(yù)，可部分抵消SHP2表達(dá)變化對(duì)SCLC細(xì)胞順鉑耐藥性的影響。
　　3. SHP2在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)SCLC順鉑耐藥性的影

17、響。與生理鹽水處理比較，H446組與 H446/CDDP-shSHP2組順鉑治療后腫瘤體積均明顯縮小，H446-SHP2組與H446/CDDP組順鉑治療后腫瘤體積差異均不顯著。這從動(dòng)物體內(nèi)水平證實(shí)高表達(dá)SHP2可導(dǎo)致小細(xì)胞肺癌對(duì)順鉑敏感性下降，部分抑制SHP2可使小細(xì)胞肺癌對(duì)順鉑敏感性增加。
　　4.臨床驗(yàn)證SHP2和CA916798表達(dá)相關(guān)性及與化療耐藥的關(guān)系
　　（1）共有20名腫瘤組織高表達(dá)SHP2的患者及12名腫瘤組

18、織低表達(dá)SHP2的患者入組分析，兩組在性別、年齡、初始化療周期等方面的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。20名高表達(dá)SHP2的小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤組織中有13名同時(shí)高表達(dá)CA916798，而12名低表達(dá)SHP2的小細(xì)胞肺癌患者中僅有3名同時(shí)高表達(dá)CA916798（P<0.05）。表明人小細(xì)胞肺癌腫瘤組織SHP2與CA916798表達(dá)具有一定的相關(guān)性。
　?。?）生存曲線分析顯示，與小細(xì)胞肺癌腫瘤組織低表達(dá)SHP2患者比較，高表達(dá)SHP2的患者平均

19、生存時(shí)間更短。與腫瘤組織低表達(dá)CA916798患者比較，高表達(dá)CA916798的患者平均生存時(shí)間更短。說(shuō)明高表達(dá)SHP2及CA916798與患者對(duì)化療預(yù)后不佳有關(guān)。
　　結(jié)論：本研究提供的證據(jù)顯示，SHP2可促進(jìn) SCLC對(duì)順鉑耐受性增加，其機(jī)制主要是通過(guò)調(diào)節(jié) PI3K/AKT/CA916798這一信號(hào)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在臨床小細(xì)胞肺癌患者中，腫瘤組織 SHP2及 CA916798表達(dá)情況可作為化療預(yù)后相關(guān)指標(biāo)。我們的研究初步闡明SH