Shp2及NK1R在肥大細(xì)胞活化過(guò)程中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 Shp2在肥大細(xì)胞活化過(guò)程中的作用及其機(jī)制研究
　　蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2參與了許多由免疫球蛋白受體介導(dǎo)的信號(hào)通路，并在其中中發(fā)揮了很重要的作用，但是Shp2在免疫球蛋白受體FcεRI介導(dǎo)的信號(hào)通路中所起的作用卻沒(méi)有被闡述。FcεRI主要分布在肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的表面，能與免疫球蛋白E(IgE)高親和力結(jié)合。在特異性多價(jià)抗原的刺激下，F(xiàn)cεRI分子由于相互交聯(lián)，在膜表面聚集繼而被活化，由此起始胞內(nèi)一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)

2、，最終導(dǎo)致細(xì)胞活化。本研究利用Shp2表達(dá)下調(diào)的RBL-2H3肥大細(xì)胞，觀察了Shp2在RBL-2H3肥大細(xì)胞活化過(guò)程中所起的作用，并進(jìn)一步探討了Shp2在其中的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制。我們的研究表明Shp2在RBL-2H3肥大細(xì)胞的活化過(guò)程中具有不可或缺的作用。抗原誘導(dǎo)FcεRI活化后，RBL-2H3細(xì)胞的脫顆粒、鈣離子流以及各種細(xì)胞因子信使RNA(message RNA，mRNA)的合成，包括白介素-1β(interleukin-1β，IL-

3、1β)，白介素-10(interleukin-10，IL-10)和單核細(xì)胞趨化因子蛋白1(monocyte chemoattractant protein1，MCP-1)，都由于Shp2的低表達(dá)而被顯著抑制。采用免疫印跡(immunoblotting)，免疫共沉淀(immunoprecipitation)以及GST-pull down等分子生物學(xué)研究手段，我們發(fā)現(xiàn)Shp2表達(dá)下調(diào)的RBL-2H3肥大細(xì)胞相比正常的RBL-2H3肥大細(xì)胞，

4、活化后胞內(nèi)許多重要的信號(hào)分子活性都被抑制，這些分子包括Fyn，Akt, JNK，p38MAPK以及Ras/Erk1/2.進(jìn)一步的研究表明FcεRI活化后，由于Shp2表達(dá)下調(diào)，信號(hào)分子Paxillin的磷酸化水平也被下調(diào)，但CbP/PAG的磷酸化不受影響?？傊?，我們的研究結(jié)果表明，IgE受體FcεRI在RBL-2H3細(xì)胞膜表面交聯(lián)后，胞內(nèi)蛋白Shp2通過(guò)調(diào)節(jié)Fyn和Ras的活性促進(jìn)了RBL-2H3肥大細(xì)胞的活化。Shp2對(duì)這個(gè)過(guò)程的調(diào)節(jié)

5、不需要CbP/PAG的參與。同時(shí)，我們的研究結(jié)果揭示Paxillin在FcεRI起始的信號(hào)通路中作為Shp2下游的一個(gè)間接底物，發(fā)揮促進(jìn)RBL-2H3肥大細(xì)胞活化的作用。
　　第二部分 Neurokinin1 receptor(NK1R)在肥大細(xì)胞活化過(guò)程中的作用及其機(jī)制研究
　　肥大細(xì)胞是炎癥反應(yīng)中的主要效應(yīng)細(xì)胞。在特異性抗原的刺激下，肥大細(xì)胞借由其表面受體FcεRI的交聯(lián)啟動(dòng)肥大細(xì)胞活化，使之釋放大量的炎性介質(zhì)，促進(jìn)了炎

6、癥的發(fā)生發(fā)展。因此對(duì)肥大細(xì)胞活化機(jī)制的研究，可以幫助我們找到更特異更有效的治療炎癥疾病的治療靶點(diǎn)。大量的研究表明，神經(jīng)肽受體neurokinin1receptor(NK1R)與多種炎癥疾病密切相關(guān)，提示NK1R可能參與了肥大細(xì)胞的活化過(guò)程。本部分研究利用RBL-2H3肥大細(xì)胞為研究對(duì)象，構(gòu)建特異性耙向NK1R的小發(fā)夾RNA（shRNA），通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方式將shRNA轉(zhuǎn)入野生型RBL-2H3肥大細(xì)胞從而下調(diào)NK1R在RBL-2H3肥大細(xì)

7、胞中的表達(dá)水平。構(gòu)建肥大細(xì)胞活化模型，觀察NK1R的表達(dá)下調(diào)對(duì)肥大細(xì)胞活化的影響，并探討NK1R在肥大細(xì)胞活化過(guò)程中所參與的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制。我們的研究結(jié)果顯示，RBL-2H3肥大細(xì)胞活化后，由于NK1R的表達(dá)下調(diào)，單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)信使RNA(mRNA)的表達(dá)水平明顯降低;同時(shí)胞內(nèi)鈣離子濃度提升的幅度（鈣離子流）也顯著地低于NK1R正常表達(dá)的細(xì)胞。這些結(jié)果表明，NK1R在RBL-2H3肥大細(xì)胞的活化過(guò)程中扮演著重要角色。更進(jìn)

8、一步，對(duì)NK1R在RBL-2H3細(xì)胞中的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，NK1R的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞活化后絲裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)，包括Erk1/2，JNK及p38MAPK，磷酸化過(guò)程被部分抑制，即NK1R的表達(dá)下調(diào)降低了MAPKs在RBL-2H3細(xì)胞活化過(guò)程中的活性。這提示NK1R在RBL-2H3肥大細(xì)胞的活化過(guò)程中參與了對(duì)MAPK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。
　　綜上所述，本