Shp2及NK1R在肥大細胞活化過程中的作用及其機制研究.pdf

1、第一部分 Shp2在肥大細胞活化過程中的作用及其機制研究
　　蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2參與了許多由免疫球蛋白受體介導的信號通路，并在其中中發(fā)揮了很重要的作用，但是Shp2在免疫球蛋白受體FcεRI介導的信號通路中所起的作用卻沒有被闡述。FcεRI主要分布在肥大細胞和嗜堿性粒細胞的表面，能與免疫球蛋白E(IgE)高親和力結(jié)合。在特異性多價抗原的刺激下，F(xiàn)cεRI分子由于相互交聯(lián)，在膜表面聚集繼而被活化，由此起始胞內(nèi)一系列信號級聯(lián)反應(yīng)

2、，最終導致細胞活化。本研究利用Shp2表達下調(diào)的RBL-2H3肥大細胞，觀察了Shp2在RBL-2H3肥大細胞活化過程中所起的作用，并進一步探討了Shp2在其中的信號調(diào)節(jié)機制。我們的研究表明Shp2在RBL-2H3肥大細胞的活化過程中具有不可或缺的作用?？乖T導FcεRI活化后，RBL-2H3細胞的脫顆粒、鈣離子流以及各種細胞因子信使RNA(message RNA，mRNA)的合成，包括白介素-1β(interleukin-1β，IL-

3、1β)，白介素-10(interleukin-10，IL-10)和單核細胞趨化因子蛋白1(monocyte chemoattractant protein1，MCP-1)，都由于Shp2的低表達而被顯著抑制。采用免疫印跡(immunoblotting)，免疫共沉淀(immunoprecipitation)以及GST-pull down等分子生物學研究手段，我們發(fā)現(xiàn)Shp2表達下調(diào)的RBL-2H3肥大細胞相比正常的RBL-2H3肥大細胞，

4、活化后胞內(nèi)許多重要的信號分子活性都被抑制，這些分子包括Fyn，Akt, JNK，p38MAPK以及Ras/Erk1/2.進一步的研究表明FcεRI活化后，由于Shp2表達下調(diào)，信號分子Paxillin的磷酸化水平也被下調(diào)，但CbP/PAG的磷酸化不受影響?？傊覀兊难芯拷Y(jié)果表明，IgE受體FcεRI在RBL-2H3細胞膜表面交聯(lián)后，胞內(nèi)蛋白Shp2通過調(diào)節(jié)Fyn和Ras的活性促進了RBL-2H3肥大細胞的活化。Shp2對這個過程的調(diào)節(jié)

5、不需要CbP/PAG的參與。同時，我們的研究結(jié)果揭示Paxillin在FcεRI起始的信號通路中作為Shp2下游的一個間接底物，發(fā)揮促進RBL-2H3肥大細胞活化的作用。
　　第二部分 Neurokinin1 receptor(NK1R)在肥大細胞活化過程中的作用及其機制研究
　　肥大細胞是炎癥反應(yīng)中的主要效應(yīng)細胞。在特異性抗原的刺激下，肥大細胞借由其表面受體FcεRI的交聯(lián)啟動肥大細胞活化，使之釋放大量的炎性介質(zhì)，促進了炎

6、癥的發(fā)生發(fā)展。因此對肥大細胞活化機制的研究，可以幫助我們找到更特異更有效的治療炎癥疾病的治療靶點。大量的研究表明，神經(jīng)肽受體neurokinin1receptor(NK1R)與多種炎癥疾病密切相關(guān)，提示NK1R可能參與了肥大細胞的活化過程。本部分研究利用RBL-2H3肥大細胞為研究對象，構(gòu)建特異性耙向NK1R的小發(fā)夾RNA（shRNA），通過瞬時轉(zhuǎn)染的方式將shRNA轉(zhuǎn)入野生型RBL-2H3肥大細胞從而下調(diào)NK1R在RBL-2H3肥大細

7、胞中的表達水平。構(gòu)建肥大細胞活化模型，觀察NK1R的表達下調(diào)對肥大細胞活化的影響，并探討NK1R在肥大細胞活化過程中所參與的信號調(diào)節(jié)機制。我們的研究結(jié)果顯示，RBL-2H3肥大細胞活化后，由于NK1R的表達下調(diào)，單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)信使RNA(mRNA)的表達水平明顯降低;同時胞內(nèi)鈣離子濃度提升的幅度（鈣離子流）也顯著地低于NK1R正常表達的細胞。這些結(jié)果表明，NK1R在RBL-2H3肥大細胞的活化過程中扮演著重要角色。更進

8、一步，對NK1R在RBL-2H3細胞中的信號調(diào)節(jié)機制研究發(fā)現(xiàn)，NK1R的表達下調(diào)導致細胞活化后絲裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)，包括Erk1/2，JNK及p38MAPK，磷酸化過程被部分抑制，即NK1R的表達下調(diào)降低了MAPKs在RBL-2H3細胞活化過程中的活性。這提示NK1R在RBL-2H3肥大細胞的活化過程中參與了對MAPK信號通路的調(diào)節(jié)。
　　綜上所述，本