XPA在黑素瘤細(xì)胞順鉑耐藥中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　黑素瘤是起源于表皮黑素細(xì)胞的惡性腫瘤，其致死率高、治療困難。除了早期切除外，目前針對(duì)中晚期黑素瘤尚無(wú)有效的治療方法。作為經(jīng)典的化療藥物，順鉑與其他化療藥物或免疫、靶向藥物聯(lián)合可增加臨床治療的有效率，特別是對(duì)一線治療后無(wú)效、進(jìn)展以及復(fù)發(fā)的患者，順鉑治療仍具有重要作用。然而腫瘤細(xì)胞化療耐藥的發(fā)生極大的限制了順鉑等鉑類藥物的臨床應(yīng)用，因此深入探討黑素瘤細(xì)胞順鉑耐藥的機(jī)制對(duì)黑素瘤患者，特別是中晚期患者的治療尤為重要。
　

2、　順鉑可與DNA形成鏈內(nèi)及鏈間加合物抑制細(xì)胞復(fù)制及轉(zhuǎn)錄，并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair,NER）可修復(fù)受損DNA，抑制凋亡發(fā)生，是腫瘤細(xì)胞順鉑耐藥的主要原因。作為NER中的關(guān)鍵分子，著色性干皮病A組（Xeroderma pigmentosumgroup A,XPA）蛋白具有識(shí)別損傷、穩(wěn)定修復(fù)結(jié)構(gòu)及招募下游修復(fù)蛋白的多種作用。既往在鼻咽癌、肺腺癌、前列腺癌等癌癥的研究中發(fā)現(xiàn)，XPA

3、高表達(dá)是腫瘤細(xì)胞順鉑耐藥的重要原因。然而XPA是否參與黑素瘤順鉑耐藥，目前尚未闡明。
　　自噬是細(xì)胞內(nèi)重要的生理過(guò)程，其通過(guò)降解并再利用細(xì)胞內(nèi)變性、受損及失去功能的細(xì)胞器及蛋白等成分維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)并為細(xì)胞提供必要的營(yíng)養(yǎng)成分。大量研究表明化療藥物作用于腫瘤細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)自噬水平增加并可導(dǎo)致耐藥發(fā)生。然而腫瘤細(xì)胞內(nèi)調(diào)控自噬應(yīng)對(duì)化療打擊的機(jī)制目前尚未完全闡明。研究表明，針對(duì)DNA損傷的修復(fù)過(guò)程常會(huì)消耗大量能量，而自噬恰恰具有能量供給功能

4、，提示損傷修復(fù)可能是化療藥物治療后自噬激活的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。此外，已有研究證實(shí)化療藥物作用后，一些DNA修復(fù)分子可直接參與激活細(xì)胞內(nèi)自噬水平。最新的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，XPA缺陷細(xì)胞內(nèi)存在線粒體自噬障礙，提示XPA可能參與細(xì)胞內(nèi)自噬的調(diào)控。基于以上研究發(fā)現(xiàn)，我們提出以下科學(xué)假說(shuō)：順鉑作用于黑素瘤細(xì)胞后，NER通路活化促進(jìn)DNA損傷修復(fù)并介導(dǎo)自噬激活，造成腫瘤細(xì)胞順鉑耐藥。XPA作為NER修復(fù)中的重要分子，可能在該過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。
　

5、　目的：
　　1.分析并驗(yàn)證XPA表達(dá)水平與黑素瘤細(xì)胞順鉑耐藥的相關(guān)性；
　　2.闡明XPA參與黑素瘤細(xì)胞順鉑耐藥的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)黑素細(xì)胞及黑素瘤細(xì)胞XPA mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)；同時(shí)，利用細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒（cellcountingkit-8 assay，CCK8）對(duì)順鉑處理后黑素細(xì)胞及黑素瘤細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)順鉑IC50值進(jìn)行計(jì)算；明確二者的相關(guān)性；
　

6、　2.干涉XPA表達(dá)，利用CCK8檢測(cè)XPA干涉對(duì)黑素瘤細(xì)胞順鉑耐藥的影響；利用western blot、流式技術(shù)檢測(cè)XPA干涉對(duì)順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響；
　　3.分別利用western blot、電鏡、免疫熒光技術(shù)檢測(cè)順鉑處理對(duì)黑素瘤細(xì)胞自噬水平的影響；
　　4.干涉XPA表達(dá)，利用western blot、免疫熒光技術(shù)檢測(cè)XPA干涉對(duì)順鉑誘導(dǎo)自噬的影響；
　　5.干涉XPA表達(dá)，利用western blot技術(shù)檢測(cè)

7、XPA干涉對(duì)PARP1活化的影響；
　　6.干涉PARP1表達(dá)或應(yīng)用PARP1抑制劑，利用western blot、免疫熒光技術(shù)檢測(cè)PARP1干涉及活性抑制對(duì)順鉑誘導(dǎo)自噬的影響；
　　7.干涉PARP1表達(dá)，利用western blot技術(shù)檢測(cè)PARP1干涉對(duì)mTOR活化、HMGB1出核及表達(dá)的影響；
　　8.干涉ATG12或PARP1表達(dá)，利用克隆形成技術(shù)檢測(cè)ATG12或PARP1干涉對(duì)順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的影響；

8、>　　結(jié)果：
　　1.與黑素細(xì)胞系相比，不同黑素瘤細(xì)胞系中XPA表達(dá)水平均升高且與順鉑耐藥水平呈正相關(guān)；選取XPA高表達(dá)且耐藥性高的Hs294T、A2058兩株細(xì)胞系為研究對(duì)象進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；
　　2.CCK8結(jié)果顯示：干涉XPA表達(dá)可增加黑素瘤細(xì)胞順鉑敏感性；
　　3.Western blot及流式結(jié)果顯示：干涉XPA表達(dá)可增加順鉑誘導(dǎo)的Caspase3活化及細(xì)胞凋亡的發(fā)生；
　　4.Western blot、電

9、鏡、免疫熒光結(jié)果顯示：順鉑處理后黑素瘤細(xì)胞內(nèi)自噬水平增加；
　　5.Western blot及免疫熒光結(jié)果顯示：干涉XPA表達(dá)可抑制順鉑誘導(dǎo)的自噬水平增加；
　　6.Western blot結(jié)果顯示：干涉XPA表達(dá)可抑制順鉑誘導(dǎo)的PARP1活化；
　　7.Western blot、免疫熒光結(jié)果顯示：干涉PARP1表達(dá)或抑制PARP1活性可抑制順鉑誘導(dǎo)的自噬水平增加；
　　8. Western blot結(jié)果顯示：干

10、涉PARP1表達(dá)可抑制順鉑誘導(dǎo)的HMGB1表達(dá)增加及出核；
　　9.克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：干涉ATG12或PARP1表達(dá)可增加黑素細(xì)胞順鉑敏感性，且干涉PARP1的治療效果優(yōu)于干涉ATG12。
　　結(jié)論：
　　通過(guò)本課題的研究，我們首次發(fā)現(xiàn)黑素瘤細(xì)胞中順鉑處理后XPA可通過(guò)活化PARP1促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)自噬水平升高。這一機(jī)制與XPA介導(dǎo)的NER修復(fù)共同促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞順鉑耐藥的發(fā)生。我們的發(fā)現(xiàn)加深了對(duì)黑素瘤順鉑耐藥機(jī)制的認(rèn)識(shí)，