XPA在黑素瘤細胞順鉑耐藥中的作用及機制研究.pdf

1、背景：
　　黑素瘤是起源于表皮黑素細胞的惡性腫瘤，其致死率高、治療困難。除了早期切除外，目前針對中晚期黑素瘤尚無有效的治療方法。作為經(jīng)典的化療藥物，順鉑與其他化療藥物或免疫、靶向藥物聯(lián)合可增加臨床治療的有效率，特別是對一線治療后無效、進展以及復發(fā)的患者，順鉑治療仍具有重要作用。然而腫瘤細胞化療耐藥的發(fā)生極大的限制了順鉑等鉑類藥物的臨床應用，因此深入探討黑素瘤細胞順鉑耐藥的機制對黑素瘤患者，特別是中晚期患者的治療尤為重要。
　

2、　順鉑可與DNA形成鏈內(nèi)及鏈間加合物抑制細胞復制及轉(zhuǎn)錄，并最終導致細胞凋亡。核苷酸切除修復（nucleotide excision repair,NER）可修復受損DNA，抑制凋亡發(fā)生，是腫瘤細胞順鉑耐藥的主要原因。作為NER中的關鍵分子，著色性干皮病A組（Xeroderma pigmentosumgroup A,XPA）蛋白具有識別損傷、穩(wěn)定修復結構及招募下游修復蛋白的多種作用。既往在鼻咽癌、肺腺癌、前列腺癌等癌癥的研究中發(fā)現(xiàn)，XPA

3、高表達是腫瘤細胞順鉑耐藥的重要原因。然而XPA是否參與黑素瘤順鉑耐藥，目前尚未闡明。
　　自噬是細胞內(nèi)重要的生理過程，其通過降解并再利用細胞內(nèi)變性、受損及失去功能的細胞器及蛋白等成分維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)并為細胞提供必要的營養(yǎng)成分。大量研究表明化療藥物作用于腫瘤細胞后，細胞內(nèi)自噬水平增加并可導致耐藥發(fā)生。然而腫瘤細胞內(nèi)調(diào)控自噬應對化療打擊的機制目前尚未完全闡明。研究表明，針對DNA損傷的修復過程常會消耗大量能量，而自噬恰恰具有能量供給功能

4、，提示損傷修復可能是化療藥物治療后自噬激活的關鍵環(huán)節(jié)。此外，已有研究證實化療藥物作用后，一些DNA修復分子可直接參與激活細胞內(nèi)自噬水平。最新的一項研究發(fā)現(xiàn)，XPA缺陷細胞內(nèi)存在線粒體自噬障礙，提示XPA可能參與細胞內(nèi)自噬的調(diào)控?；谝陨涎芯堪l(fā)現(xiàn)，我們提出以下科學假說：順鉑作用于黑素瘤細胞后，NER通路活化促進DNA損傷修復并介導自噬激活，造成腫瘤細胞順鉑耐藥。XPA作為NER修復中的重要分子，可能在該過程中發(fā)揮關鍵的調(diào)控作用。
　

5、　目的：
　　1.分析并驗證XPA表達水平與黑素瘤細胞順鉑耐藥的相關性；
　　2.闡明XPA參與黑素瘤細胞順鉑耐藥的分子機制。
　　方法：
　　1.利用qRT-PCR技術對黑素細胞及黑素瘤細胞XPA mRNA水平進行檢測；同時，利用細胞增殖與毒性檢測試劑盒（cellcountingkit-8 assay，CCK8）對順鉑處理后黑素細胞及黑素瘤細胞活性進行檢測并對順鉑IC50值進行計算；明確二者的相關性；
　

6、　2.干涉XPA表達，利用CCK8檢測XPA干涉對黑素瘤細胞順鉑耐藥的影響；利用western blot、流式技術檢測XPA干涉對順鉑誘導細胞凋亡的影響；
　　3.分別利用western blot、電鏡、免疫熒光技術檢測順鉑處理對黑素瘤細胞自噬水平的影響；
　　4.干涉XPA表達，利用western blot、免疫熒光技術檢測XPA干涉對順鉑誘導自噬的影響；
　　5.干涉XPA表達，利用western blot技術檢測

7、XPA干涉對PARP1活化的影響；
　　6.干涉PARP1表達或應用PARP1抑制劑，利用western blot、免疫熒光技術檢測PARP1干涉及活性抑制對順鉑誘導自噬的影響；
　　7.干涉PARP1表達，利用western blot技術檢測PARP1干涉對mTOR活化、HMGB1出核及表達的影響；
　　8.干涉ATG12或PARP1表達，利用克隆形成技術檢測ATG12或PARP1干涉對順鉑誘導細胞毒性的影響；

8、>　　結果：
　　1.與黑素細胞系相比，不同黑素瘤細胞系中XPA表達水平均升高且與順鉑耐藥水平呈正相關；選取XPA高表達且耐藥性高的Hs294T、A2058兩株細胞系為研究對象進行后續(xù)實驗；
　　2.CCK8結果顯示：干涉XPA表達可增加黑素瘤細胞順鉑敏感性；
　　3.Western blot及流式結果顯示：干涉XPA表達可增加順鉑誘導的Caspase3活化及細胞凋亡的發(fā)生；
　　4.Western blot、電

9、鏡、免疫熒光結果顯示：順鉑處理后黑素瘤細胞內(nèi)自噬水平增加；
　　5.Western blot及免疫熒光結果顯示：干涉XPA表達可抑制順鉑誘導的自噬水平增加；
　　6.Western blot結果顯示：干涉XPA表達可抑制順鉑誘導的PARP1活化；
　　7.Western blot、免疫熒光結果顯示：干涉PARP1表達或抑制PARP1活性可抑制順鉑誘導的自噬水平增加；
　　8. Western blot結果顯示：干

10、涉PARP1表達可抑制順鉑誘導的HMGB1表達增加及出核；
　　9.克隆形成實驗結果顯示：干涉ATG12或PARP1表達可增加黑素細胞順鉑敏感性，且干涉PARP1的治療效果優(yōu)于干涉ATG12。
　　結論：
　　通過本課題的研究，我們首次發(fā)現(xiàn)黑素瘤細胞中順鉑處理后XPA可通過活化PARP1促進細胞內(nèi)自噬水平升高。這一機制與XPA介導的NER修復共同促進黑素瘤細胞順鉑耐藥的發(fā)生。我們的發(fā)現(xiàn)加深了對黑素瘤順鉑耐藥機制的認識，