間皮素在卵巢上皮性癌診斷、病情監(jiān)測中的價(jià)值評(píng)價(jià)及在順鉑耐藥中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、卵巢上皮性癌(Epithelial ovarian cance,EOC,簡稱卵巢癌)是女性生殖系統(tǒng)常見的一種惡性腫瘤,致死率在婦科腫瘤中占首位,五年生存率僅為30％。這是因?yàn)槁殉舶┰缙谠\斷困難,70％的患者確診時(shí)已是晚期。而且晚期患者在經(jīng)過腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合以鉑類為基礎(chǔ)的化療后,雖然得到緩解,但是60％的患者最終會(huì)復(fù)發(fā),其中主要的原因是出現(xiàn)順鉑耐藥。因此臨床亟需新的卵巢癌腫瘤標(biāo)志物和解決順鉑耐藥的新的途徑。
　　 間皮素(Mes

2、othelin MSLN)是一種新發(fā)現(xiàn)的腫瘤細(xì)胞表面抗原,在正常組織中通常僅表達(dá)在體腔表面的間皮細(xì)胞,在惡性間皮瘤、卵巢癌和胰腺癌等惡性腫瘤中過表達(dá)。間皮素基因編碼的間皮素蛋白是一種以糖基磷脂酰肌醇錨定在細(xì)胞膜上的糖蛋白,全長69KDa,可被蛋白水解酶分裂釋放出一個(gè)33KDa的可溶性蛋白,另外遺留下膜結(jié)合的蛋白(40KDa)作為細(xì)胞粘附分子。可溶性間皮素相關(guān)蛋白(Soluble mesothelin relatedprotein SMR

3、P)是42-45KDa的蛋白質(zhì),可能為膜結(jié)合間皮素的蛋白水解產(chǎn)物。由于SMRP可以釋放入血且分子量明顯低于卵巢癌標(biāo)記物CA125,所以理論上靈敏度要高于CA125,從而有希望成為卵巢癌早期診斷的標(biāo)記物。
　　 目前的研究證實(shí)間皮素可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,增強(qiáng)其粘附、遷移的能力,但是還有很多生物學(xué)功能尚不可知。有研究發(fā)現(xiàn)間皮素在卵巢癌順鉑耐藥組織中明顯高表達(dá),且與不良預(yù)后相關(guān),提示間皮素的表達(dá)與化療耐藥有關(guān)。由此我們推斷間皮素可能在

4、卵巢癌順鉑耐藥過程中發(fā)揮著重要作用,有望成為順鉑耐藥治療的新的靶點(diǎn)。
　　 本課題首先將間皮素與卵巢癌常用標(biāo)志物CA125和新發(fā)現(xiàn)的重要卵巢癌標(biāo)志物HE4做同期比較,并分別將三者聯(lián)合檢測,對(duì)間皮素的臨床價(jià)值作出客觀評(píng)價(jià)。然后從基因水平和蛋白水平分別檢測卵巢癌耐藥細(xì)胞株間皮素的表達(dá)。接著以SKOV3/cDDP細(xì)胞為例,應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默耐藥細(xì)胞株表面間皮素的表達(dá),進(jìn)而通過MTT藥物敏感試驗(yàn)、集落形成試驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)來檢測間皮素沉

5、默后耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的變化,并從耐藥蛋白表達(dá)的改變,細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平等方面探討間皮素在順鉑耐藥方面的可能作用機(jī)制。最后我們建立荷人卵巢癌耐藥細(xì)胞株裸鼠移植瘤模型,用包裝有間皮素siRNA的慢病毒液聯(lián)合順鉑進(jìn)行治療,在體內(nèi)水平進(jìn)一步驗(yàn)證間皮素沉默后耐藥卵巢癌組織對(duì)順鉑的敏感性,探討間皮素沉默逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的可能性,從而為卵巢癌的耐藥逆轉(zhuǎn)研究提供一個(gè)新的思路。
　　 第一部分血清SMRP和HE4在卵巢上皮性癌診斷和病情監(jiān)測中的臨

6、床應(yīng)用
　　 目的:比較血清SMRP和HE4在卵巢良惡性腫瘤和健康志愿者的分布,結(jié)合CA125,分析三種標(biāo)志物單獨(dú)和聯(lián)合檢測的診斷效能,探討血清SMRP和HR4在卵巢癌診斷和病情監(jiān)測中的臨床價(jià)值。
　　 方法:用酶聯(lián)免疫吸附法測定44例卵巢癌患者,56例良性卵巢上皮性腫瘤患者和40例健康志愿者血清中的SMRP和HE4水平,化學(xué)發(fā)光法測定血清CA125,比較三種標(biāo)志物在不同分組,卵巢癌不同病理類型、不同分化級(jí)別、不同分期及

7、良性卵巢上皮性腫瘤不同病理類型的分布,比較三種標(biāo)志物在卵巢癌術(shù)前術(shù)后的變化。繪制ROC曲線對(duì)三種標(biāo)志物進(jìn)行診斷效能評(píng)價(jià)。分析三種標(biāo)志物聯(lián)合檢測的診斷價(jià)值。
　　 結(jié)果:
　　 1卵巢癌的SMRP、HE4和CA125水平均高于良性上皮性腫瘤和健康志愿者(P＜0.05),差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2漿液性癌的SMRP、HE4和CA125水平均明顯高于粘液性癌,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3Ⅰ

8、-Ⅱ期的SMRP、HE4和CA125水平均明顯低于Ⅲ-Ⅳ期,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4 G3的SMRP、HE4和CA125水平明顯高于G2、G1,差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 5 漿液性囊腺瘤和粘液性囊腺瘤的血清SMRP、HE4和CA125水平分布差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 6 進(jìn)行了理想腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)的22例患者術(shù)后的SMRP、HE4和CA125水平明顯降低,與

9、術(shù)前相比差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 7 SMRP的ROC曲線下面積(AUC)為0.861,其95％的可信區(qū)間為(0.778-0.944);HE4的AUC為0.905,其95％的可信區(qū)間為(0.830-0.980);CA125的AUC為0.984,其95％的可信區(qū)間為(0.969-0.999)。
　　 8 根據(jù)ROC曲線,HE4具有最高的特異性(1),SMRP次之(97.92％),CA125最后(89.58

10、％);CA125具有最高的靈敏度(90.91％),HE4次之(86.36％),SMRP最后(77.27％)。
　　 9 Kappa,一致性檢驗(yàn):HE4的Kappa值為0.897(P=0.000),SMRP的Kappa值為0.791(P-0.000),CA125的Kappa值為0.776(P=0.000)。10比較三種標(biāo)志物的聯(lián)合檢測:CA125分別與HE4、SMRP進(jìn)行平行聯(lián)合檢測靈敏度最高:95.45％,臟4與SMRP平行聯(lián)合

11、檢測特異度最高:97.92％,三者的聯(lián)合并不能提高特異度。在系列聯(lián)合檢測中,三者的任意聯(lián)合特異度均為1。
　　 結(jié)論:
　　 1 卵巢癌的SMRP水平明顯高于良性卵巢上皮性腫瘤和健康志愿者,漿液性癌的SMRP水平明顯高于粘液性癌,隨著分化級(jí)別的降低,病理分期的增加,血清SMRP水平升高。
　　 2 卵巢癌的HE4水平明顯高于良性卵巢上皮性腫瘤和健康志愿者,漿液性卵巢癌的HE4水平明顯高于粘液性癌。隨著分化級(jí)別的降

12、低,病理分期的增加,血清HE4水平升高。
　　 3 卵巢癌實(shí)施理想腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)后與術(shù)前相比,血清SMRP和HE4水平均明顯下降,這兩種指標(biāo)可作為卵巢癌病情監(jiān)測的指標(biāo)。
　　 4 血清SMRP,HE4與CA125相比均具有較高的特異度,與臨床診斷一致性方面:HE4明顯優(yōu)于SMRP和CA125,SMRP與CA125基本相當(dāng)或略優(yōu)于CA125。CA125無論聯(lián)合HE4還是SMRP均可以明顯提高靈敏度或特異度,不需要三種標(biāo)志物

13、聯(lián)合。SMRP和HE4可在一定程度上補(bǔ)充完善CA125用于卵巢癌診斷和病情監(jiān)測的缺陷。
　　 第二部分 siRNA介導(dǎo)的間皮素沉默在逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥過程中的作用
　　 目的:檢測間皮素(MSLN)在卵巢癌耐藥細(xì)胞株上的表達(dá),觀察MSLN沉默后耐藥細(xì)胞株對(duì)順鉑的敏感性,驗(yàn)證MSLN沉默是否可逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥,探討MSLN在卵巢癌順鉑耐藥中的可能作用及機(jī)制,加深對(duì)卵巢癌順鉑耐藥機(jī)制的理解。
　　 方法:培養(yǎng)SKOV3和

14、3AO及相應(yīng)的耐藥細(xì)胞:SKOV3/cDDP和3AO/cDDP。應(yīng)用MTT技術(shù)檢測細(xì)胞的IC50,計(jì)算耐藥指數(shù)(耐藥指數(shù)=IC50耐藥細(xì)胞/IC50親本細(xì)胞)。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)分別從基因水平和蛋白水平檢測四種細(xì)胞株上MSLN的表達(dá)。應(yīng)用RNAi技術(shù)將耐藥細(xì)胞株SKOV3/cDDP中的MSLN沉默,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,分成三組細(xì)胞:①干擾組(SKOV3/cDDP-LV-MSLN-RNAi細(xì)胞)②陰性

15、組(SKOV3/cDDP-LV-MSLN-neg細(xì)胞);③空白組(SKOV3/cDDP細(xì)胞)。三組細(xì)胞分別加入順鉑構(gòu)成實(shí)驗(yàn)組,不加順鉑者構(gòu)成對(duì)照組。用MTT法測定三組細(xì)胞在順鉑作用48h時(shí)的抑制率,抑制率(％)=(1-OD值實(shí)驗(yàn)組/OD值對(duì)照組)×100％,用SPSS13.0軟件計(jì)算IC50。用集落形成實(shí)驗(yàn)檢測三組細(xì)胞在順鉑作用下的集落抑制率,集落抑制率(％)=(1-克隆實(shí)驗(yàn)組/克隆對(duì)照組)×100％。用流式細(xì)胞術(shù)測定順鉑作用48h時(shí)三

16、組細(xì)胞的凋亡率,順鉑誘導(dǎo)的凋亡率(％)=凋亡率實(shí)驗(yàn)組-凋亡率對(duì)照組。用Westen Blot檢測實(shí)驗(yàn)組三組細(xì)胞P-gP,GST-π蛋白的表達(dá)。用比色法測定細(xì)胞內(nèi)GSH水平。
　　 結(jié)果:
　　 1 SKOV3/cDDP耐藥指數(shù)為4.5,3AO/cDDP耐藥指數(shù)為4.2,屬于低度耐藥。
　　 2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果:SKOV3細(xì)胞RQ值為1.228±0.259,SKOV3/cDDP細(xì)胞RQ值為1.933±0.2

17、52,3AO細(xì)胞RQ值為0.972±0.139,3AO/cDDP細(xì)胞RQ值為1.595±0.106,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=26.403,P=0.000),其中與SKOV3/cDDP明顯高于SKOV3,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=O.000);3AO/cDDP高于3AO,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000);SKOV3/cDDP高于3AO/cDDP,差別也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008);SKOV3明顯高于3AO,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0

18、.039)。
　　 3 MSLN蛋白表達(dá)結(jié)果:各細(xì)胞株的蛋白含量分別為:3AO為(0.115±0.078),3AO/cDDP為(0.655±0.121),SKOV3組為(0.309±0.130),SKOV3/cDDP組為(0.902±0.137)。四種細(xì)胞株MSLN蛋白表達(dá)差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=61.511,P=0.000),其中SKOV3/cDDP明顯高于SKOV3,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000);3AO/cDDP明顯

19、高于3AO,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000);SKOV3/cDDP高于3AO/cDDP,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000);SKOV3明顯高于3AO,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
　　 4 慢病毒轉(zhuǎn)染SKOV3/cDDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為80-90％,干擾效率為95.72％。
　　 5 實(shí)驗(yàn)組三組細(xì)胞暴露于順鉑48h后,各組細(xì)胞抑制率均隨順鉑濃度的增加而升高,其中干擾組增加最顯著?？瞻捉M的IC50為(5.365

20、±0.259)mg/L,陰性組的IC50為(5.248±0.422)mg/L,干擾組的IC50為(2.661±0.158)mg/L,三者相比差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=77.851,P=0.000),其中干擾組的IC50明顯低于其他兩組(P=0.000),其他兩組IC50相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.651)。干擾組細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性提高了約2.01倍。
　　 6 空白組、陰性組和干擾組的集落抑制率分別為(44.683±3.767)

21、％,(45.488±3.303)％,(64.56±2.904)％,三組相比差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=67.935,P=0.000),干擾組的集落抑制率明顯高于其他兩組,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),陰性組和空白組的集落抑制率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.683)。
　　 7 流式細(xì)胞術(shù)凋亡率:空白組、陰性組和干擾組順鉑誘導(dǎo)的凋亡率分別為(19.667±5.417)％,(18.733±7.057)％,(39.867±5.463)％,三

22、組相比差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.774,P=0.008)。干擾組順鉑誘導(dǎo)的凋亡率明顯高于其他兩組,差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),其他兩組相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.85)。
　　 8 空白組、陰性組和干擾組三組細(xì)胞P-gP蛋白含量分別為(0.868±0.153),(0.796±0.105),(0.764±0.103),三組細(xì)胞相比差別無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.322,P=0.291)。
　　 9 空白組、陰性組

23、和干擾組三組細(xì)胞GST-π的蛋白含量分別為(1.266±0.137),(1.248±0.135),(0.485±0.163),三種細(xì)胞相比差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=65.706,P=0.000)。其中干擾組的GST-π水平明顯低于陰性組和空白組(P＜0.05),陰性組和空白組相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.820)。
　　 10 空白組GSH含量為(45.993±5.726)nmol/mg,陰性組GSH含量為(44.971±3.82

24、4)nmol/mg,干擾組GSH含量(24.743±4.659)nmol/mg。三組相比差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=49.876,P=0.000),其中干擾組明顯低于其他兩組(P＜0.05),其他兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.674)。
　　 結(jié)論:
　　 1 從基因水平及蛋白水平上證實(shí)了耐藥細(xì)胞株表面的間皮素表達(dá)明顯高于敏感細(xì)胞株。
　　 2 漿液性卵巢癌細(xì)胞株的間皮素表達(dá)水平高于粘液性卵巢癌細(xì)胞株。
　　 3

25、 間皮素沉默后卵巢癌耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性明顯增強(qiáng),間皮素在一定程度上逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥。
　　 4 間皮素沉默逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的可能機(jī)制:間皮素沉默通過下調(diào)GST-π蛋白的表達(dá),降低耐藥細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的含量,減少谷胱甘肽與順鉑的結(jié)合,順鉑作用增強(qiáng),從而逆轉(zhuǎn)耐藥。
　　 5 間皮素沉默逆轉(zhuǎn)耐藥的作用機(jī)制較復(fù)雜,可能多種因素參與此過程。
　　 第三部分siRNA介導(dǎo)的間皮素沉默聯(lián)合順鉑治療耐藥卵巢癌裸鼠移植瘤的效果
　

26、　 目的:觀察MSLN沉默后裸鼠移植瘤對(duì)順鉑敏感性,進(jìn)一步闡明MSLN在卵巢癌順鉑耐藥中的作用。
　　 方法:建立荷人卵巢癌耐藥細(xì)胞裸鼠腹腔移植瘤模型。將SKOV3/cDDP細(xì)胞接種于裸鼠腹腔,成瘤后用包裝有間皮素siRNA的慢病毒液和順鉑進(jìn)行治療,分成六組:干擾組、干擾+cDDP組、陰性組、陰性+cDDP組、空白組和cDDP組。比較6組裸鼠的一般狀況,生存期。裸鼠解剖后比較6組裸鼠的移植瘤數(shù)目和重量,用流式細(xì)胞術(shù)測定6組裸鼠

27、移植瘤組織的凋亡率,單純由順鉑誘導(dǎo)的凋亡率用AA表示,△A=加順鉑組的凋亡率—加PBS組的凋亡率,用Western Blot測定間皮素的干擾效率。
　　 結(jié)果:
　　 1 干擾組的移植瘤數(shù)目及重量均顯著少于陰性組和空白組(P＜0.05),干擾+cDDP組的移植瘤數(shù)目及重量最少,明顯少于其他5組,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),陰性組的移植瘤數(shù)目及重量與空白組相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 2 干

28、擾組、陰性組、陰性+cDDP組、空白組和cDDP組的裸鼠均在接種腫瘤細(xì)胞后30天內(nèi)全部死亡,中位生存期分別為28,26,27,25,25天,其中干擾組的中位生存期長于其他4組,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。干擾+cDDP組的中位生存期為38天,與其他5組相比生存期明顯延長(P=0.000),差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3 干擾組、干擾+cDDP組、陰性組、陰性+cDDP組、空白組和cDDP組移植瘤組織的MSIN蛋白含量分別

29、為0.115、0.121、0.855、0.864、0.876、0.869,干擾組和干擾+cDDP組的干擾率分別為86.87％、86.08％。
　　 4 流式細(xì)胞術(shù)測凋亡率:干擾組的凋亡率高于陰性組和空白組,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000),干擾+cDDP組的凋亡率明顯高于陰性+cDDP組和cDDP組,差別也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。陰性組的凋亡率與空白組相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.907),陰性+cDDP組的凋亡率

30、與cDDP組相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.837)。單純由順鉑誘導(dǎo)的凋亡率干擾組(40.96±4.746)％明顯高于陰性組(19.88±4.356)％和空白組(19.26±4.746)％,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
　　 結(jié)論:
　　 1 用包裝有間皮素siRNA的慢病毒載體成功將移植瘤組織間皮素沉默,間皮素沉默本身能抑制腫瘤細(xì)胞的生長,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,腫瘤生長速度減慢。
　　 2 對(duì)于耐藥卵巢癌組織,