間皮素在卵巢上皮癌中的診斷價值及負載間皮素的DC疫苗抗卵巢癌細胞效應(yīng)的研究.pdf

1、卵巢癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，90％的卵巢癌為卵巢上皮癌（Epithelial Ovarian Cancer，EOC），其死亡率居各種生殖器官腫瘤的首位。卵巢癌早期缺乏特異性癥狀，一旦確診往往已經(jīng)是晚期。早期患者5年生存率能夠達到90％，晚期患者的5年生存率僅為5-20％。絕大多數(shù)患者經(jīng)過腫瘤細胞減滅術(shù)以及紫杉醇與鉑類聯(lián)合化療后只能在一段時期內(nèi)病情得到緩解，最終出現(xiàn)化療抵抗而死亡。因此，尋找新的早期診斷篩查指標(biāo)、尋找特異有效的治療方

2、法是提高卵巢癌患者生存率亟待解決的問題。
　　間皮素(Mesothelin, MSLN)是一種分子質(zhì)量為40KDa的細胞表面糖蛋白，通常只在人體體腔表面的間皮細胞表達，在其他正常組織中不表達，但是在一些惡性腫瘤如間皮瘤、胰腺癌、卵巢癌等中過度表達。研究證實間皮素在腫瘤細胞生存、侵襲和腫瘤進展方面起著重要作用。間皮素與CA125有很高的親和力，二者共同作用參與細胞粘附，與腫瘤的腹腔種植轉(zhuǎn)移有關(guān)?？扇苄蚤g皮素相關(guān)蛋白(Soluble

3、mesothelin related protein，SMRP)是分子量為42-45KDa的蛋白，是由間皮素基因編碼蛋白的其中一個異構(gòu)體在翻譯過程中翻譯提前終止，從細胞表面脫落形成。SMRP分子量小，它不僅在血清中可以檢測到，在腹水和尿液中同樣可以檢測到。因此，SMRP有可能成為卵巢癌早期診斷的篩查指標(biāo)，而且間皮素組織特異性表達方式使它成為理想的腫瘤免疫治療的靶點。
　　腫瘤疫苗是免疫治療的重要組成部分，是利用腫瘤細胞或腫瘤抗原誘

4、導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，達到清除腫瘤細胞的目的。樹突狀細胞（Dendritic Cell，DC）疫苗是腫瘤疫苗的一種。DC是體內(nèi)最強的抗原遞呈細胞，能夠攝取腫瘤抗原，誘導(dǎo)生成細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic lymphocyte，CTL)，從而介導(dǎo)強有力的特異性抗腫瘤細胞免疫。近幾年來，關(guān)于卵巢癌DC疫苗的研究已經(jīng)取得了一定的成果。
　　本課題首先檢測卵巢上皮癌、良性卵巢上皮腫瘤、正常人群血清及尿液間皮素水平，將其與血清C

5、A125的臨床價值作同期比較;同時將尿液及血清間皮素分別聯(lián)合血清CA125檢測作為卵巢上皮癌診斷的臨床價值作出客觀評價。然后采用PCR技術(shù)克隆間皮素全長的cDNA，通過測序證實序列正確后，提取無內(nèi)毒素的間皮素質(zhì)粒，再制備負載間皮素cDNA的慢病毒載體，并對其進行鑒定。最后應(yīng)用負載人間皮素全長cDNA的慢病毒感染DC，構(gòu)建卵巢上皮癌的新型DC疫苗，通過Western Blot技術(shù)驗證病毒轉(zhuǎn)染的DC強烈表達間皮素，進而通過DC作為間皮素的遞

6、送細胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生具有間皮素特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，通過LDH釋放法、流式細胞術(shù)、IFN-γ檢測等一系列方法測定CTL對卵巢上皮癌細胞產(chǎn)生特異性殺傷作用。期望通過本課題研究為卵巢癌的早期診斷和免疫治療提供新的研究思路。
　　第一部分血清及尿液中間皮素檢測在卵巢上皮癌中的診斷價值
　　目的:檢測血清及尿液中的SMRP水平在卵巢上皮癌、良性卵巢上皮腫瘤及健康女性中的分布情況，并且與血清CA125的臨床診斷價值作比較，

7、同時將血清及尿液SMRP分別聯(lián)合血清CA125檢測作為卵巢上皮癌診斷的臨床價值作出客觀評價。
　　方法:用酶聯(lián)免疫吸附試驗方法檢測46例卵巢上皮癌患者、36例良性卵巢上皮腫瘤患者和35例健康女性血清和尿液中的SMRP水平，同時用化學(xué)發(fā)光法檢測血清CA125水平。分析血清SMRP及尿液SMRP在卵巢上皮癌患者不同病理類型、不同手術(shù)病理分期和不同病理分級的分布差異，也對良性卵巢上皮腫瘤不同病理類型患者分布作出比較。通過繪制ROC曲線對

8、三種檢測方法的診斷效能作出評價，并評價血清及尿液SMRP分別聯(lián)合血清CA125檢測的診斷價值。
　　結(jié)果:
　　1、卵巢上皮癌患者的血清SMRP(17.63±2.18ng/ml)和尿液SMRP(11.26±1.43 ng/ml)水平均高于良性卵巢上皮腫瘤患者(血清SMRP4.62±0.71ng/ml;尿液SMRP2.84±0.47ng/ml)和健康體檢者(血清SMRP2.99±0.36ng/ml;尿液SMRP0.89±0.3

9、1 ng/ml)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、漿液性癌的血清SMRP水平顯著高于粘液性癌和子宮內(nèi)膜樣癌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。粘液性癌和子宮內(nèi)膜樣癌間比較差異不顯著(P＞0.05)。三種病理類型的卵巢上皮癌患者的尿液SMRP水平比較，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3、晚期癌患者血清和尿液SMRP水平均較早期患者明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4、G3組的血清和尿

10、液SMRP水平均明顯高于G1組和G2組，差別均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），G1組和G2組比較差異無顯著性（P＞0.05）。
　　5、繪制血清SMRP、尿液SMRP和血清CA125的ROC曲線，血清SMRP的ROC曲線下面積(Area under ROC curve，AUC)為0.822，標(biāo)準(zhǔn)誤0.42，其95％的可信區(qū)間為(0.740-0.905);尿液SMRP的AUC為0.787，標(biāo)準(zhǔn)誤0.46，其95％的可信區(qū)間為(0.6

11、97-0.877);血清CA125的AUC為0.814，標(biāo)準(zhǔn)誤0.49，其95％的可信區(qū)間為(0.719-0.910)。
　　6、血清CA125靈敏度最高(76.1％)，但其特異度最低(85.5％)。血清SMRP的靈敏度(71.7％)較CA125略低，特異度(89.8％)較其增加。尿液SMRP的特異度最高(93.4％)，敏感度最低(67.4)。
　　7、對三指標(biāo)進行Kappa一致性檢驗，血清SMRP的Kappa值為0.617

12、(P=0.000)，尿SMRP的Kappa值為0.628(P=0.000)，CA125的Kappa值為0.590(P=0.000)。
　　8、血清SMRP與CA125進行并聯(lián)聯(lián)合檢測靈敏度最高(93.2％)，尿液SMRP與CA125串聯(lián)聯(lián)合檢測特異度最高(99％)。三者的聯(lián)合使敏感度略增加，但并不能提高特異度。
　　結(jié)論:
　　1、卵巢上皮癌組的血清SMRP水平顯著高于良性上皮性腫瘤組和健康對照組;漿液性癌患者較粘液性

13、癌和子宮內(nèi)膜樣癌患者血清SMRP水平顯著升高;晚期患者的血清SMRP水平顯著高于早期患者;組織學(xué)分級越差的患者血清SMRP水平越高。
　　2、卵巢上皮癌組的尿液SMRP水平顯著高于良性上皮性腫瘤組和健康對照組;漿液性癌患者較粘液性癌和子宮內(nèi)膜樣癌患者尿液SMRP水平高，但是差異不顯著;晚期患者的尿液SMRP水平顯著高于早期患者;組織學(xué)分級越差的患者尿液SMRP水平越高。
　　3、三指標(biāo)比較，血清CA125靈敏度最高，但其特異

14、度最低。血清SMRP的靈敏度較CA125略低，特異度較其增加。尿液SMRP的特異度最高，但靈敏度最低。在診斷一致性方面，尿液SMRP優(yōu)于血清SMRP和血清CA125，血清SMRP略優(yōu)于CA125。證實了血清和尿液SMRP檢測用于診斷卵巢上皮癌的應(yīng)用價值。
　　4、血清SMRP與CA125進行并聯(lián)聯(lián)合檢測靈敏度最高，尿液SMRP與CA125串聯(lián)聯(lián)合檢測特異度最高。血清、尿液SMRP檢測可以在一定程度上彌補CA125作為卵巢癌早期診斷

15、標(biāo)志物的不足。
　　第二部分間皮素cDNA的克隆及慢病毒載體的構(gòu)建
　　目的:構(gòu)建負載間皮素全長cDNA的慢病毒載體。
　　方法:應(yīng)用PCR技術(shù)克隆間皮素基因全長序列的cDNA，通過測序證實序列正確后，構(gòu)建pBOB-1質(zhì)粒表達載體，再制備負載間皮素cDNA的慢病毒載體，并對其進行滴度檢測。
　　結(jié)果:
　　1、經(jīng)過兩輪PCR獲到了大約2000bp的PCR產(chǎn)物，經(jīng)測序驗證獲得了編碼間皮素(MSLN)的cDNA

16、全長序列，其編碼區(qū)為1893 bp，編碼630個氨基酸的蛋白質(zhì)。
　　2、將MSLN編碼區(qū)cDNA兩端分別含有AgeⅠ和XhoⅠ酶切位點的PCR產(chǎn)物和經(jīng)過雙酶切的pBOB-1質(zhì)粒載體進行連接反應(yīng)，獲得了用于轉(zhuǎn)染慢病毒的pBOB-MSLN質(zhì)粒載體，并用微量分光光度計K5600檢測質(zhì)粒的純度。
　　3、成功構(gòu)建MSLN全長基因cDNA的慢病毒載體，用定量PCR方法測定病毒顆粒的滴度為6.56×106±2.1×105TU/ml。<

17、br>　　結(jié)論:
　　1、使用含有人間皮素編碼基因的cDNA文庫菌體，采用PCR擴增的方法，經(jīng)過兩輪PCR得到的產(chǎn)物，經(jīng)測序驗證獲得了編碼間皮素(MSLN)的cDNA全長序列。
　　2、本實驗中使用的慢病毒載體系統(tǒng)是四質(zhì)粒系統(tǒng)的pBOB(pCSC-SP-PW)，并用293T細胞包裝慢病毒顆粒。該載體具有宿主范圍廣，轉(zhuǎn)移基因片段容量大，不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)等優(yōu)點，更為重要的是該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達

18、到持久性表達。構(gòu)建負載間皮素全長cDNA的慢病毒載體成功后檢測病毒滴度滿意。
　　第三部分負載間皮素全長cDNA的DC疫苗抗卵巢癌細胞OVCAR3和 SKOV3效應(yīng)的研究
　　目的:構(gòu)建負載間皮素全長cDNA的DC疫苗，利用DC的抗原遞呈功能，以成熟DC為載體將間皮素遞呈給淋巴細胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生針對間皮素的特異性細胞毒性T淋巴細胞，驗證其對卵巢上皮癌腫瘤細胞產(chǎn)生強大的特異性細胞殺傷作用。
　　方法:
　　1、培養(yǎng)卵巢

19、癌細胞株OVCAR3和SKOV3，用Western Blot方法測定兩個細胞株間皮素的表達情況。
　　2、成熟DC的獲得和檢測:從外周健康新鮮血中分離獲得人外周血單核細胞，先后加入GM-CSF、IL-4、TNF-α等細胞因子培養(yǎng)9天，收獲成熟的DC。用流式細胞儀檢測成熟DC表面的CD80，CD83，CD86分子表達情況。
　　3、重組慢病毒感染DC:用構(gòu)建好的負載間皮素全長cDNA的慢病毒載體感染成熟DC（未感染的DC作為陰

20、性對照），Western Blot方法檢測MSLN在DC中的表達。
　　4、CTL細胞的獲得:將負載MSLN的慢病毒感染的DC及未感染的DC分別加入從外周健康新鮮血中分離獲得的人外周血單核細胞中孵育，并補充重組人IL-2，第7天收集CTL。
　　5、LDH釋放法測定CTL的功能:將DC-pBOB-1MSLN誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL分別與OVCAR3或SKOV3按照不同的E∶T比率孵育。通過對損傷的OVCAR3或SKOV3細胞中釋放的

21、LDH測定來評價CTL對OVCAR3或SKOV3的細胞毒作用。
　　6、流式細胞術(shù)檢測靶細胞凋亡率:用流式細胞術(shù)檢測卵巢癌細胞凋亡率來驗證CTL對OVCAR3或SKOV3的細胞毒作用。
　　7、酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測IFN-γ的釋放量:應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測DC-pBOB-1MSLN誘導(dǎo)的CTL產(chǎn)生IFN-γ的能力，用沒有轉(zhuǎn)染的DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL作為對照。
　　結(jié)果:
　　1、間皮素在OVCAR3和SKOV3細

22、胞中均有表達，其中在卵巢癌細胞株OVCAR3的表達高于SKOV3。
　　2、培養(yǎng)第9天成熟的顯微鏡下可以見到典型的成熟DC的形態(tài)。采用流式細胞術(shù)檢測成熟DC表面的CD分子抗體，結(jié)果顯示，83.07％的DC細胞表達CD80，85.80％的DC細胞表達CD86，有52.42％的DC細胞表達CD83。
　　3、Western Blot方法檢測MSLN在DC中的表達。結(jié)果顯示，間皮素在病毒轉(zhuǎn)染的DC中表達，而在未轉(zhuǎn)染的DC中不表達。

23、
　　4、間皮素特異性CTL對這兩種卵巢癌細胞的細胞毒作用隨著E:T比例增高也明顯升高。同時，在比例為50∶1和10∶1時，對OVCAR3的細胞毒性明顯高于SKOV3。說明間皮素修飾過的DC誘導(dǎo)的CTL對OVCAR3表現(xiàn)出高效的間皮素特異的細胞毒性。
　　5、用流式細胞術(shù)檢測卵巢癌細胞凋亡率:效應(yīng)細胞CTL在完成殺傷后已大部分死亡;OVCAR3和SKOV3兩種靶細胞在自然釋放條件下結(jié)果OVCAR3和SKOV3細胞的自然釋放凋

24、亡率分別為23.31％和6.8％;MSLN誘導(dǎo)的CTL對兩種靶細胞均有非常顯著的誘導(dǎo)凋亡的作用，且隨著效靶比的增高凋亡率也明顯提高，并且OVCAR3細胞比SKOV3細胞凋亡率更高;未用MSLN誘導(dǎo)的CTL對OVCAR3和SKOV3也有一定的誘導(dǎo)凋亡的作用。
　　6、與對照組相比，DC-pBOB-1MSLN誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL釋放更多的IFN-γ，兩者相比，差異有顯著性（P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1、經(jīng)過轉(zhuǎn)染的DC檢