靶向間皮素的嵌合抗原受體修飾T細胞治療卵巢癌實驗研究.pdf

1、癌癥已經(jīng)嚴重威脅到了人類的健康，對人類的生存造成了極大的危害。在全球范圍內，卵巢癌占婦科最常見癌癥的第八位，且死亡人數(shù)占婦科常見腫瘤的第七位。每年全世界約有230000名婦女被診斷為卵巢癌，而且超過75％的患者確診時已經(jīng)是晚期，卵巢癌的5年生存率低于45％。目前臨床上卵巢癌常見的治療手段包括手術、放化療等，但這些治療不能有效的控制腫瘤的復發(fā)及進展，也不能有效的延長患者的生存期及改善患者的生存質量。因此我們迫切需要尋求新的治療手段。近年來

2、生物治療成為一種重要的抗腫瘤治療手段，給攻克惡性腫瘤帶來了希望。
　　研究表明大多數(shù)的腫瘤細胞能夠躲避免疫系統(tǒng)的識別，從而限制免疫治療的抗癌效果。CAR-T（嵌合抗原受體T細胞）技術應運而生，其具有較好的靶向性、殺傷性、增殖性及持久性。大量的臨床試驗研究也表明該技術在改善惡性血液腫瘤患者生存質量及延長患者生存期方面取得了巨大的成功，CAR-T技術成為了免疫治療的研究熱點。然而該技術在實體腫瘤的研究還不夠成熟，未能得到期待的效果，仍

3、然面臨許多問題，包括:實體瘤組織特殊的病理學特征、表面缺乏合適的腫瘤特異性抗原，腫瘤周圍免疫抑制微環(huán)境、共刺激分子的優(yōu)化組合、自殺基因的設計、回輸后的不良反應等。本課題構建并檢測了靶向間皮素抗原的嵌合抗原受體T細胞對幾種卵巢癌細胞株的體外殺傷作用:
　　1、構建包含兩個胞內共刺激區(qū)（CD3ζ和4-1BB）的mesoCAR的重組質粒，再通過piggyBac轉座子系統(tǒng)轉染T細胞，獲得第二代mesoCAR-T細胞。其轉染效率為30％左右

4、。進一步證明mesoCAR能夠在T細胞中高水平穩(wěn)定表達。流式檢測經(jīng)過間皮素刺激后mesoCAR-T的活化表型的表達情況，結果表明間皮素抗原能使mesoCAR-T細胞活化。
　　2、通過流式及Westem Blot檢測多種腫瘤細胞株間皮素的表達水平，篩選出五種間皮素不同表達水平的卵巢癌細胞株。通過不同的方式檢測mesoCAR-T細胞對間皮素高表達的細胞株及低表達的細胞株的殺傷作用。結果顯示mesoCAR-T細胞對間皮素高表達細胞株的

5、殺傷作用明顯強于低表達的細胞株，并且能更有效的抑制間皮素高表達細胞株的生長。表明構建的mesoCAR-T細胞對間皮素高表達的卵巢癌細胞株具有更強的殺傷活性及靶向性。
　　3、構建靶向間皮素抗原的嵌合抗原受體T細胞(mesoCAR-T)，通過流式檢測間皮素抗原刺激后mesoCAR-T細胞的細胞因子分泌的情況，結果發(fā)現(xiàn)IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ的分泌量明顯高于對照組T細胞。同時用流式檢測mesoC

6、AR-T細胞與兩種卵巢癌細胞共培養(yǎng)后細胞因子的分泌，發(fā)現(xiàn)MesoCAR-T細胞與間皮素高表達的細胞株(HO8910)共培養(yǎng)后，IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α及IFN-γ的分泌量相比間皮素低表達的細胞株(SKOV3)升高。
　　本實驗成功的構建了靶向間皮素抗原的嵌合抗原受體T細胞(mesoCAR-T)，其結果表明本實驗室構建的piggyBac轉座酶系統(tǒng)能夠很好的將外源基因整合T細胞中，并且構建的mesoCAR-