EGFR家族中等親和力嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞的廣譜抗腫瘤效能.pdf

1、嵌合抗原受體(CAR)修飾的T細(xì)胞(CART)和T細(xì)胞受體(TCR)修飾的T細(xì)胞免疫治療是新型快速發(fā)展的免疫治療策略。CAR賦予了T細(xì)胞抗原特異性的識(shí)別，激活和增殖，依賴于主要組織相容性復(fù)合物非依賴的途徑。CAR目前發(fā)展為第三代，包含兩個(gè)共刺激分子，CD28+CD134(OX40)或CD28+CD137(4-1BB)，第三代CAR相比于第二代CAR，細(xì)胞因子分泌和裂解作用均增強(qiáng)，激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡率降低。
　　2012年，Klos

2、s CC研究小組在《Nature Biotechnology》上發(fā)表的關(guān)于調(diào)整親和力后雙載體系統(tǒng)(CAR+CCR)的殺傷特異性及效能，該研究在提高雙CAR系統(tǒng)的特異性的同時(shí)，也開啟了調(diào)控CAR載體對(duì)抗原親和力的新的優(yōu)化方向。2015年9月《Cancer Research》上發(fā)表的兩篇調(diào)整CAR載體對(duì)抗原的親和力降低脫靶效應(yīng)的研究，研究表明高親和力的CAR-T細(xì)胞對(duì)EGFR抗原低水平的和高水平表達(dá)的腫瘤細(xì)胞均有較強(qiáng)的殺傷效能，而低親和力的

3、CAR-T細(xì)胞只殺傷EGFR高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，且殺傷效能與EGFR的表達(dá)量呈正相關(guān)，因此，本課題我們選取中等親和力的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行研究，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)降低脫靶效應(yīng)。
　　調(diào)整CAR-T細(xì)胞的親和力使其特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，豁免低水平表達(dá)靶抗原的正常細(xì)胞，降低脫靶效應(yīng)。但由于腫瘤組織的異質(zhì)性，即腫瘤組織由于特殊的組織病理學(xué)的差異，靶抗原的表達(dá)量也會(huì)有所差異，降低CAR載體的親和力，也會(huì)引起靶抗原低水平表達(dá)的腫瘤細(xì)胞逃逸，豁免

4、正常細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)降低療效。因此，降低親和力，靶向單個(gè)抗原分子的CAR-T細(xì)胞無法徹底消除所有的腫瘤細(xì)胞。
　　EGFR家族EGFR(HERl/erbB-1),HER2(ErbB-2 or neu),HER-3(erbB-3)andHER-4(erbB-4)在乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、頭頸部的癌癥等多種腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，且家族成員在各種惡性腫瘤組織中的總陽性比例接近100％?；谏厦娴膬蓚€(gè)原因，我們構(gòu)建了能同時(shí)靶向EGFR家

5、族的中等親和力G3Herin-CAR-T細(xì)胞，猜想并證明其靶向識(shí)別并殺傷多種惡性腫瘤細(xì)胞，且中等親和力可以降低脫靶效應(yīng)引起對(duì)正常組織的殺傷作用。
　　第一部分 靶向EGFR家族嵌合抗原受體的構(gòu)建
　　選取靶向EGFR家族的中等親和力HERIN片段并構(gòu)建第三代CAR載體G3Herin-CAR，通過酶切鑒定及基因測(cè)序，證明我們成功構(gòu)建了G3Herin-CAR載體。
　　第二部分 靶向EGFR家族嵌合抗原受體對(duì)T細(xì)胞株的遺傳

6、修飾
　　采用電穿孔技術(shù)把G3Herin-CAR載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入健康志愿者的外周血PBMC中，用2％AIM+IL-2對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。通過蛋白免疫印跡分析，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)CAR-T轉(zhuǎn)染的陽性率和激活表型的表達(dá)，驗(yàn)證通過電轉(zhuǎn)染技術(shù)成功對(duì)T細(xì)胞株進(jìn)行遺傳修飾，并在T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)G3Herin-CAR目的基因。
　　第三部分 靶向EGFR家族嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞的體外效能檢測(cè)
　　本部分實(shí)驗(yàn)，采用蛋白免疫印跡分析、流

7、式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EGFR家族蛋白的表達(dá)篩選合適的腫瘤細(xì)胞，用Recombinant human EGFR抗原刺激G3Herin-CAR-T細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-r，TNF-a的分泌量，利用xCELLigence RTCA DP儀器實(shí)時(shí)檢測(cè)CAR-T細(xì)胞對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，評(píng)估G3Herin-CAR-T細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性效能。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了最初的設(shè)計(jì):靶向EGFR家族的中等親和力pNBS328-G3Herin-