靶向間皮素的嵌合抗原受體修飾T細胞(mesoCAR-T)治療肝癌的實驗研究.pdf

1、癌癥現(xiàn)在已成為人類健康的頭號殺手，世界范圍內(nèi)，肝癌發(fā)病率在所有癌癥中居第六位，每年約有750萬新增病例，死亡率高居第三位?？焖俚纳罟?jié)奏、巨大的工作壓力、不健康的飲食習慣、糟糕的環(huán)境都是癌癥發(fā)生的幫兇，使得癌癥的高發(fā)率和年輕化趨勢也越來越明顯。早期肝癌進行有效治療后五年生存率能達到50％–70%。但是由于肝癌早期診斷技術的限制，肝癌總的五年生存率只有10%。目前常用的治療手段主要包括手術切除、肝臟移植、化療、化療栓塞、射頻消融、質子射線

2、療法等，但效果十分有限。因此，仍需探索一個更加有效的治療方法，來提高肝癌生存率和生存質量。近年來免疫療法的興起，即利用自身免疫系統(tǒng)來抵御癌癥，給癌癥患者帶來了新的希望。
　　然而，癌癥患者自身的免疫系統(tǒng)受損嚴重，狡猾的腫瘤細胞又會通過MHC分子的低表達或不表達來逃脫免疫細胞的攻擊，這些都給治療帶來了很大困難。因此，精密制導、精準打擊的免疫細胞武器—CAR-T技術應運而生。
　　CAR-T細胞，即嵌合型抗原受體修飾的T細胞，這

3、種通過基因修飾T細胞的過繼性免疫細胞療法，可以克服MHC介導的免疫逃逸機制，快速建立腫瘤免疫并消除小型或大型腫瘤負擔，被認為是一種很有前景的治療策略。尤其是靶向CD19的CAR-T細胞在惡性血液病中取得的巨大成功，開創(chuàng)了腫瘤生物治療的新紀元。
　　CAR-T技術雖在惡性血液病中獲得驚人效果，運用到實體瘤時卻處處碰壁，除了實體瘤更加復雜的腫瘤抑制微環(huán)境外，還面臨著很多問題：缺乏類似于CD19這樣特異的靶點，轉染效率不高，CAR的數(shù)量

4、和CAR的親和力等。本文構建并檢測了針對間皮素的第二代CAR T細胞對幾種肝癌細胞株的體外殺傷作用：
　　(1)構建包含CD3ζ和4-1BB兩個胞內(nèi)共刺激區(qū)的mesoCAR，通過piggyBac轉座子系統(tǒng)轉染T細胞，獲得mesoCAR-T細胞。替代常用的慢病毒載體轉染方式，其陽性率可達到66%。流式檢測K562-meso刺激下mesoCAR-T的活化表型（CD137，CD28，CD27，CD134，CD38，CD107α），結果顯

5、示mesoCAR-T細胞可被K562-meso細胞激活。
　　(2)通過RT-PCR、Western Blot檢測多種腫瘤細胞株間皮素的表達水平，并人工構建間皮素高表達細胞株。篩選出了四種不同表達水平的肝癌細胞株，檢測mesoCAR-T細胞對高表達（SMMC-7721、BEL-7404）及低表達細胞株（HepG2、Huh7）的殺傷作用差異。結果顯示mesoCAR-T細胞對間皮素高表達細胞株的殺傷作用明顯強于低表達或不表達間皮素的細

6、胞株，表明構建的mesoCAR-T細胞具有一定的特異性。
　　(3)通過檢測mesoCAR-T細胞的細胞因子發(fā)現(xiàn)，IFN-γ、TNF-α、IL2的分泌明顯高于對照組T細胞。mesoCAR-T與腫瘤細胞共培養(yǎng)IFN-γ的分泌量與腫瘤細胞株間皮素的表達量也基本成正比關系。
　　(4)SMMC-7721小鼠移植瘤模型中，與PBS和control T細胞組相比，mesoCAR-T細胞治療組對腫瘤的抑制作用更強，且能在體內(nèi)更好地增殖。