嵌合scFvEGFRvIII-CD28-CD3ζ受體修飾T細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng).pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是成人最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腦瘤，盡管其治療方式有多種，但最大范圍的手術(shù)切除、放療和化療都未能達(dá)到滿意療效。這些治療方式因?qū)φＤX組織和其他組織具有非特異性損傷而受到了限制。傳統(tǒng)治療方式的缺點(diǎn)刺激了新療法的發(fā)展，相比較而言，免疫治療是一個(gè)精確的療法，能夠有效的靶向神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，減少脫靶效應(yīng)對(duì)正常腦組織導(dǎo)致的間接損傷。大量臨床證據(jù)已展示免疫治療在B細(xì)胞惡性腫瘤和實(shí)體腫瘤等治療上所具有的潛力。
　　嵌合抗原受體（chimeric

2、antigen receptor，CAR）是一種久經(jīng)考驗(yàn)的方法，它將特異性抗體的可變區(qū)與T細(xì)胞的功能結(jié)合，表達(dá)于T淋巴細(xì)胞表面介導(dǎo)其抗原特異性激活，CAR在腎細(xì)胞癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病等惡性疾病的治療中表現(xiàn)出了非凡的潛能，在過(guò)去的20多年里，有關(guān)CAR的技術(shù)發(fā)展極其迅速，CAR也已經(jīng)從實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)化到膠質(zhì)瘤的臨床治療中。
　　表皮生長(zhǎng)因子受體III型突變體（epidermal growth facto

3、r receper variant III，EGFRvIII）表達(dá)于腦膠質(zhì)瘤和其他惡性腫瘤的表面而在正常組織不表達(dá)，是靶向治療的最佳靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建嵌合抗原受體 scFvEGFRvIII-CD28-CD3ζ，利用 scFvEGFRvIII實(shí)現(xiàn)靶向免疫治療膠質(zhì)瘤細(xì)胞，共刺激分子CD28促進(jìn)T細(xì)胞的擴(kuò)增，延長(zhǎng)T細(xì)胞壽命，CD3ζ激活T細(xì)胞毒性反應(yīng)。以慢病毒為載體介導(dǎo)EGFRvIII/CD28-CAR重定向T細(xì)胞，使T細(xì)胞特異性識(shí)別并殺傷EG

4、FRvIII陽(yáng)性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞（EGFRvIII+U87MG），是膠質(zhì)瘤免疫治療的新思路。
　　目的：構(gòu)建第二代慢病毒表達(dá)載體pCDH-CD28-CAR；探討EGFRvIII/CD28-CAR+T細(xì)胞對(duì)EGFRvIII+U87MG細(xì)胞的體外生物學(xué)效應(yīng)。
　　方法：第一部分①委托公司合成基因片段 Hinge-TM-CD28-CD3ζ；將Hinge-TM-CD28-CD3ζ克隆至慢病毒表達(dá)載體 pCDH-EF1-MCS-T2A-c

5、opGFP的 BamHI和EcoRI位點(diǎn)，獲得的載體被命名為 pCDH-CD28-CD3ζ；PCR擴(kuò)增 pCR2.1TOPO中的scFvEGFRvIII基因序列；將scFvEGFRvIII克隆至pCDH-CD28-CD3ζ的EcoRI位點(diǎn)，采用菌落PCR方法判斷scFvEGFRvIII與pCDH-CD28-CD3ζ的連接是否正確，最后DNA測(cè)序鑒定各堿基是否正確，新載體命名為pCDH-CD28-CAR。②通過(guò)磷酸鈣沉淀法將三質(zhì)粒（包膜蛋

6、白質(zhì)粒pVSVG、包裝質(zhì)粒pDel8.9和pCDH-CD28-CAR）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝慢病毒；使用蔗糖超速離心沉淀法濃縮慢病毒上清液；使用有限稀釋法測(cè)定慢病毒（LV–EGFRvIII/CD28-CAR）的滴度。
　　第二部分①慢病毒 LV–EGFRvIII/CD28-CAR感染運(yùn)用免疫磁珠技術(shù)分離、激活、擴(kuò)增的健康供著外周血CD3+T細(xì)胞。②運(yùn)用Western blot和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EGFRvIII/CD28-CAR在T細(xì)

7、胞的表達(dá)情況，ELISA法檢測(cè)效靶共培養(yǎng)上清細(xì)胞因子IFN-γ的分泌水平，51Cr釋放法檢測(cè)EGFRvIII/CD28-CAR+T細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。
　　結(jié)果：第一部分①DNA測(cè)序鑒定CAR的scFvEGFRvIII、Hinge、TM、CD28和CD3ζ的序列和連接正確，成功構(gòu)建了慢病毒表達(dá)載體 pCDH-CD28-CAR；②包裝的慢病毒LV-EGFRvIII/CD28-CAR滴度高達(dá)1.2x108 TU/ml，LV-EGFRvII

8、I/CD28-CAR感染T細(xì)胞的效率高達(dá)73.9％。
　　第二部分體外實(shí)驗(yàn)顯示效靶細(xì)胞共培養(yǎng)上清中可檢測(cè)到明顯的 IFN-γ分泌，EGFRvIII/CD28-CAR+T細(xì)胞可以特異性的殺傷EGFRvIII+U87細(xì)胞，EGFRvIII/CD28-CAR+T細(xì)胞發(fā)揮殺傷效應(yīng)和分泌IFN-γ均依賴U87MG細(xì)胞EGFRvIII的表達(dá)。
　　結(jié)論：體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了EGFRvIII/CD28-CAR+T細(xì)胞對(duì)EGFRvIII+U87M