5-FC對CD基因修飾的SHG-44惡性人腦膠質瘤細胞凋亡誘導作用的研究.pdf

1、背景與目的：腦膠質瘤是顱內最常見的惡性腫瘤，盡管近年來在手術、放療、化療和免疫治療等方面已取得很大進展，但療效仍不樂觀，5年生存率不足50％。隨著分子生物學的發(fā)展和基因工程技術的進步，使基因治療膠質瘤成為可能，而自殺基因治療是其中的一種重要方法。經典自殺基因一般編碼非哺乳動物酶類，可將無毒的前藥轉變?yōu)楦叨拘源x產物。因此，全身使用無毒性前藥可導致腫瘤部位毒性藥物產生并發(fā)揮抗腫瘤效應。胞嘧啶脫氨酶(CD)僅存在于酵母或細菌體內，哺乳動物細

2、胞內不含該酶，它可將抗真菌藥物5-氟胞嘧啶(5-FC)轉變?yōu)榭鼓[瘤藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)。本研究在離體狀態(tài)下將CD基因轉染SHG-44惡性人腦膠質瘤細胞，建立CD／5-FC自殺基因系統(tǒng)：進而通過體外試驗探討CD／5-FC系統(tǒng)能否抑制惡性人腦膠質瘤細胞的生長及其作用機理，以期為CD／5-FC系統(tǒng)在體治療膠質瘤試驗打下基礎，為該治療系統(tǒng)盡快步入臨床提供實驗資料。 方法：1．將所獲取的pCMVCD表達質粒擴增并抽提純化，限制性內

3、切酶Bam HI和Not I酶切鑒定pCMVCD質粒。分別以SP6與T7啟動子進行CD基因測序。2.SHG-44細胞在含10％FBS／DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)。3．離體狀態(tài)下采用脂質體Lipofectamine2000試劑將pCMVCD表達質粒轉染SHG-44細胞。經G418篩選培養(yǎng)，2-3周后獲取G41 8抗性細胞克隆(即SHG-44／CD細胞)。免疫細胞化學試驗檢測SHG．44／CD細胞CD抗體表達。4．將SHG-44／CD和SHG

4、-44細胞接種到96孔板內，加入含不同濃度的5-FC培養(yǎng)液培養(yǎng)。第7天采用常規(guī)MTT法進行比色分析，確定活細胞比率。5．將SHG-44／CD細胞和SHG-44細胞按一定比例混合，加入5-FC后7天按MTT法測細胞存活率，檢測CD／5-FC自殺基因治療系統(tǒng)是否存在“旁觀者效應”。6．采用流式細胞儀、TUNEL實驗法及透射電子顯微鏡評價5-FC對SHG-44／CD細胞凋亡的誘導作用。7．所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包進行處理。

5、 結果：1．限制性內切酶Bam HI和Not I消化證實CD基因插入真核表達載體的多克隆位點。CD基因編碼區(qū)為1284 bp，與基因庫收錄序列完全一致。 2．SHG-44細胞在10％FBS／DMEM培養(yǎng)液中生長良好；通過脂質體將含CD基因的質粒轉染進入SHG-44細胞，G418篩選獲得抗性克隆SHG-44／CD細胞，CD抗體免疫細胞化學染色顯示SHG-44／CD細胞成功地表達了CD。3．MTT法顯示：轉染CD基因的SHG-44／C

6、D細胞在低濃度5-FC培養(yǎng)液孵育7天后，細胞出現(xiàn)明顯死亡，IC50為 10 μ mol／L；而未轉染的SHG-44細胞對5-FC不敏感，IC<,50>約為6500 μ mol／L；二者相比有顯著性差異(p<0.05)。SHG-44和SHG-44／CD細胞在1000 μmol／L 5-FC作用下，形態(tài)學有明顯不同，7天后SHG-44細胞生存狀態(tài)良好，SHG-44／CD細胞則出現(xiàn)生長抑制和死亡。4．CD／5-FC自殺基因治療系統(tǒng)存在“旁觀

7、者效應”，可以殺傷未轉染的膠質瘤細胞，細胞存活率與兩種細胞混合比例以及5-FC濃度密切相關，它們之間存在顯著性差異(p<0.05)。 5.轉染CD基因的SHG-44／CD細胞和SHG-44細胞在含5-FC的培養(yǎng)液中培養(yǎng)72h，TUNEL顯示絕大多數(shù)細胞胞核呈黃染表現(xiàn)，凋亡細胞比例極高，SHG-44細胞則未見胞核黃染現(xiàn)象：透射電鏡鏡下可見SHG-44／CD細胞出現(xiàn)凋亡特征性改變，但SHG-44細胞未發(fā)現(xiàn)現(xiàn)象；流式細胞術檢測顯示，SHG-

8、44／CD細胞的凋亡率最高可達18.6％，明顯高于對照組(p<0.05)，其凋亡率也隨5-FC濃度的增加而遞增，呈現(xiàn)出劑量依賴性，并且與對照組相比，SHG-44／CD細胞周期各時相分布出現(xiàn)變化(p<0.05)。細胞周期分析顯示5-FC將SHG-44／CD細胞阻止于G1期，S期細胞減少。 結論：1．成功地建立了SHG-44惡性人腦膠質瘤細胞的CD／5-FC自殺基因系統(tǒng)。CD抗體免疫細胞化學染色顯示SHG-44／CD細胞可穩(wěn)定、高效