逆轉錄病毒載體介導Fcy∷Fur融合基因聯(lián)合5-FC對膠質瘤細胞C6殺傷作用的體內外研究.pdf

1、本研究的目的是為了研究融合型自殺基因Fcy：：Fur聯(lián)合5-FC對膠質瘤細胞C6的殺傷作用。根據逆轉錄病毒表達載體pLXSN的多克隆位點及質粒pORF5-Fcy：：Fur上Fcy：：Fur的基因序列，設計PCR引物，在引物的5’端分別引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點，采用常規(guī)PCR從pORF5-Fcy：：Fur中擴增出Fcy：：Fur融合基因，經核酸序列測定正確后，分別克隆進pLXSN。經雙酶切鑒定無誤后，轉染包裝細胞PT67，擴大培

2、養(yǎng)陽性克隆并收集上清，獲得重組逆轉錄病毒。重組病毒感染靶細胞C6，以G418篩選得到穩(wěn)定表達Fcy：：Fur的陽性細胞株，并經抽提細胞基因組DNA和RNA分別進行PCR和RT-PCR等鑒定目的基因的整合。在穩(wěn)定表達Fcy：：Fur的C6細胞中加入5-FC，MTT法測定腫瘤細胞殺傷效應并計算細胞生長抑制率、免疫組化檢測凋亡相關蛋白Fas及Bcl-2的表達、流式細胞儀檢測細胞凋亡比例及電鏡觀察等方面來研究對腫瘤細胞殺傷情況。裸鼠皮下移植C6

3、-Fcy：：Fur、C6-PLXSN及C6細胞后腹腔注射5-FC或PBS液，比較裸鼠生存期及腫瘤大小，并觀察流式細胞儀檢測結果及電鏡下表現(xiàn)。結果顯示：融合型自殺基因Fcy：：Fur聯(lián)合5-FC在體內外可對膠質瘤細胞C6產生明顯的殺傷作用，與對照組相比，細胞增殖明顯受抑制；電鏡下可觀察到凋亡小體；流式細胞儀檢測實驗組細胞凋亡率明顯大于對照組，提示細胞凋亡可能參與了殺傷機制。免疫組化發(fā)現(xiàn)5-FC加入后，發(fā)生了Fas、Bcl-2表達的下調，提