逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)Fcy∷Fur融合基因聯(lián)合5-FC對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6殺傷作用的體內(nèi)外研究.pdf

1、本研究的目的是為了研究融合型自殺基因Fcy：：Fur聯(lián)合5-FC對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的殺傷作用。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLXSN的多克隆位點(diǎn)及質(zhì)粒pORF5-Fcy：：Fur上Fcy：：Fur的基因序列，設(shè)計(jì)PCR引物，在引物的5’端分別引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，采用常規(guī)PCR從pORF5-Fcy：：Fur中擴(kuò)增出Fcy：：Fur融合基因，經(jīng)核酸序列測(cè)定正確后，分別克隆進(jìn)pLXSN。經(jīng)雙酶切鑒定無(wú)誤后，轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞PT67，擴(kuò)大培

2、養(yǎng)陽(yáng)性克隆并收集上清，獲得重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。重組病毒感染靶細(xì)胞C6，以G418篩選得到穩(wěn)定表達(dá)Fcy：：Fur的陽(yáng)性細(xì)胞株，并經(jīng)抽提細(xì)胞基因組DNA和RNA分別進(jìn)行PCR和RT-PCR等鑒定目的基因的整合。在穩(wěn)定表達(dá)Fcy：：Fur的C6細(xì)胞中加入5-FC，MTT法測(cè)定腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率、免疫組化檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Fas及Bcl-2的表達(dá)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例及電鏡觀察等方面來(lái)研究對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷情況。裸鼠皮下移植C6

3、-Fcy：：Fur、C6-PLXSN及C6細(xì)胞后腹腔注射5-FC或PBS液，比較裸鼠生存期及腫瘤大小，并觀察流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果及電鏡下表現(xiàn)。結(jié)果顯示：融合型自殺基因Fcy：：Fur聯(lián)合5-FC在體內(nèi)外可對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6產(chǎn)生明顯的殺傷作用，與對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖明顯受抑制；電鏡下可觀察到凋亡小體；流式細(xì)胞儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯大于對(duì)照組，提示細(xì)胞凋亡可能參與了殺傷機(jī)制。免疫組化發(fā)現(xiàn)5-FC加入后，發(fā)生了Fas、Bcl-2表達(dá)的下調(diào)，提