腎癌T細(xì)胞受體庫(kù)深度測(cè)序的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景及目的：
　　腎細(xì)胞癌（Renal cell carcinoma，RCC）是腎臟最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占腎臟所有腫瘤的85％。腎臟的細(xì)胞癌來(lái)源于腎臟的腎小管上皮，其中最為常見(jiàn)的是腺癌。每年會(huì)有209000腎癌新發(fā)病例，因腎癌而死亡的人數(shù)高達(dá)102000人。腎癌的手術(shù)切除仍是當(dāng)前最理想和最好的減瘤方法，是治療晚期和轉(zhuǎn)移性腎臟細(xì)胞癌的可選的方法之一，但是容易復(fù)發(fā)。由于腎癌對(duì)放化療不敏感，導(dǎo)致放化療對(duì)患有腎癌的病人治療效果不佳。根據(jù)以

2、往的研究，我們知道腎癌有著非常特殊的生物學(xué)行為，例如，腎癌病灶可以自發(fā)的消退，而且偶爾還能觀察到腎癌的轉(zhuǎn)移病灶會(huì)長(zhǎng)期處于休眠狀態(tài)。經(jīng)過(guò)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，人體的免疫體統(tǒng)在排斥腫瘤的免疫細(xì)胞反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用。因此，免疫治療（主動(dòng)免疫、被動(dòng)免疫、特異性和非特異性）似乎成為治療腎癌的有效方法。在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，由于體細(xì)胞異?；蛲蛔兊姆e累，而導(dǎo)致細(xì)胞表達(dá)異常的抗原，并呈現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞表面，這是一個(gè)病理性遺傳改變的結(jié)果。腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)的T細(xì)胞（TIL）能夠特

3、異性的識(shí)別這些表達(dá)異常抗原的細(xì)胞，并可以觸發(fā)抗腫瘤的獲得性免疫反應(yīng)。然而，來(lái)源于同一組織類型的腫瘤細(xì)胞也會(huì)呈現(xiàn)出不同類型的腫瘤相關(guān)抗原表位，在腫瘤復(fù)雜的微環(huán)境下，這些多樣性的腫瘤表面抗原能夠誘導(dǎo)特異性異質(zhì)性的T細(xì)胞浸潤(rùn)，其中衡量浸潤(rùn)的異質(zhì)性的T細(xì)胞主要指標(biāo)是浸潤(rùn)強(qiáng)度、T細(xì)胞亞型的組成和不均勻的空間分布。
　　CD8+的腫瘤浸潤(rùn) T細(xì)胞能夠直接介導(dǎo)腫瘤相關(guān)抗原的識(shí)別和細(xì)胞毒性反應(yīng)，人們對(duì)CD8+T細(xì)胞的功能已有了很好的了解。然而，對(duì)

4、于CD4+的T細(xì)胞來(lái)說(shuō)，由于他們?cè)谀[瘤灶內(nèi)多樣的亞型和多變的生物學(xué)特性，使得人們還有很多關(guān)于CD4+T細(xì)胞未知的東西等待探索。自體的CD4+TIL的輔助功能可能是增強(qiáng)和維持TAA-激活的CD8+T細(xì)胞的有效細(xì)胞毒性反應(yīng)。同時(shí)，近幾年研究發(fā)現(xiàn)CD4+TILs可以在CD8+T細(xì)胞缺失的情況下，通過(guò)PRF1/GZMB或Th1/M1樣巨噬細(xì)胞依賴的機(jī)制單獨(dú)殺傷腫瘤細(xì)胞。因此，了解哪一種類型的腫瘤內(nèi)進(jìn)浸潤(rùn)的T細(xì)胞在腫瘤的刺激下而活化和決定抗原特異

5、性選擇的因素都將是非常有趣且很有意義的研究，為病人的個(gè)體化治療帶來(lái)全新的方法。
　　人體的免疫系統(tǒng)能夠有效的識(shí)別眾多的腫瘤相關(guān)抗原，主要得益于T細(xì)胞表面多樣性的受體TCR，TCR是早期在胸腺中TCRA和TCRB位點(diǎn)基因隨機(jī)重組形成的。位于TCR上的互補(bǔ)決定區(qū)3 CDR3是識(shí)別異?？乖慕Y(jié)合點(diǎn)，CDR3決定了TCR的特異性和識(shí)別抗原結(jié)合區(qū)域的長(zhǎng)度，同時(shí)影響TCR受體庫(kù)的多樣性使TCR受體能夠識(shí)別各種不同的抗原。腫瘤特異性的T細(xì)胞有效

6、的活化和后來(lái)的擴(kuò)增，隨之會(huì)帶來(lái)多樣性的特異的TCR的表達(dá)。因此，如果能夠量化這些擴(kuò)增的TCR克隆的類型，將為人們理解和應(yīng)用好腫瘤特異性T細(xì)胞反應(yīng)帶來(lái)革命性的突破。近年來(lái)，人們應(yīng)用高通量測(cè)序的方法分析免疫系統(tǒng)的免疫組庫(kù)，為人們了解免疫體統(tǒng)提供了更清晰的觀點(diǎn)。高通量的測(cè)序技術(shù)目前主要應(yīng)用于克隆的追蹤、分析免疫受體庫(kù)的特點(diǎn)和識(shí)別定義常見(jiàn)的克隆。我們的實(shí)驗(yàn)研究主要是利用多重PCR技術(shù)分析和測(cè)序T細(xì)胞的CDR3區(qū)域，其中T細(xì)胞主要來(lái)源于10個(gè)腎癌

7、病人腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)的T細(xì)胞、癌旁內(nèi)的T細(xì)胞和外周血T細(xì)胞。通過(guò)高通量的深度測(cè)序技術(shù)來(lái)建立腎癌內(nèi)特殊的腫瘤微環(huán)境和TIL受體庫(kù)之間的聯(lián)系。
　　這里我們應(yīng)用高通量測(cè)序的方法分別對(duì)腎癌病人腫瘤病灶內(nèi)、癌旁組織和外周血內(nèi)T細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，分析CD4+/CD8+ TIL的特點(diǎn)。通過(guò)對(duì)比我們主要想解決一下問(wèn)題：1.分析T細(xì)胞受體庫(kù)中TCRB上V/J基因片段的使用特征，2.腫瘤內(nèi)是否存在高頻擴(kuò)增的T細(xì)胞，并確定其亞型，3.受體庫(kù)多樣性的變化，4.若

8、存在高頻的T細(xì)胞克隆，是否為抗原所驅(qū)動(dòng)，5.腫瘤內(nèi)活化的T細(xì)胞來(lái)源于癌旁or外周血，6.病人間腫瘤內(nèi)是否存在相同的抗原.
　　材料和方法：
　　取未經(jīng)過(guò)其他免疫治療的腎癌病人的標(biāo)本，包括腫瘤組織、癌旁組織和外周血。用酶消化法處理腫瘤組織和癌旁組織，消化所得到的細(xì)胞用濃度40%和80%的Percoll進(jìn)行濃度梯度離心得到組織內(nèi)淋巴細(xì)胞。同時(shí)用淋巴細(xì)胞分離液分出外周血中的淋巴細(xì)胞。有磁珠分選法，將得到的淋巴細(xì)胞分選為CD4+T細(xì)

9、胞和CD8+T細(xì)胞并分別放置于不同的Trizol中進(jìn)行處理。接著分別提取CD4+T和CD8+T細(xì)胞的RNA，將得到的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增得到相對(duì)穩(wěn)定的cDNA，再將得到的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。隨后進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，來(lái)驗(yàn)證PCR產(chǎn)物是否為自己所需，若得到了自己所需的條帶后，將瓊脂糖膠條帶切下進(jìn)行膠的回收處理，重新分離出所需的目的DNA并保存。將保存的DNA樣本經(jīng)過(guò)TCR深度測(cè)序儀處理的到原始的TCR代碼，將原始的代碼用數(shù)學(xué)軟件MATLA

10、B進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析和處理。
　　結(jié)果：
　　成功的分離篩選得到病人癌組織、癌旁組織和外周血內(nèi)的CD4+和CD8+ T細(xì)胞，成功的通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增得到所需的目的條帶并經(jīng)膠回收得到所需樣本。樣本順利的經(jīng)過(guò)測(cè)序處理分析后得到的原始代碼結(jié)果MATLAB處理后我們發(fā)現(xiàn)：1）腎癌腫瘤內(nèi)CD4 T細(xì)胞TRBV/J基因片段特征與癌旁組織內(nèi)顯著不同；2）腎癌腫瘤內(nèi)包含高頻率擴(kuò)增CD4 T細(xì)胞克隆而CD8+T沒(méi)有此現(xiàn)象；3）腫瘤內(nèi)CD4 T

11、細(xì)胞受體庫(kù)多樣性降低；4）腫瘤內(nèi)CD4 T細(xì)胞擴(kuò)增呈現(xiàn)抗原驅(qū)動(dòng)特征；5）腫瘤內(nèi)高頻率CD4 T細(xì)胞主要來(lái)源于癌旁組織；6）腫瘤內(nèi)CD4 T細(xì)胞呈現(xiàn)異質(zhì)的抗原特異性擴(kuò)增。
　　結(jié)論：
　　1.成功的應(yīng)用TCR深度測(cè)序的技術(shù)測(cè)量了腎癌病人的癌組織、癌旁組織、和外周血中CD4+/CD8+T細(xì)胞的受體庫(kù)。
　　2.CD4+腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞（TIL）受體庫(kù)表現(xiàn)為TRBV/J片段不同的使用，而CD8+TIL無(wú)明顯差異。