細(xì)胞-微粒皮法修復(fù)深度創(chuàng)面的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　研究表皮細(xì)胞與自體微粒皮聯(lián)合修復(fù)深度創(chuàng)面的效果，為救治大面積深度燒傷患者，促進(jìn)創(chuàng)面的修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.表皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)與功能表皮細(xì)胞的構(gòu)建
　　取新鮮人體包皮組織，通過兩步酶消化法分離得到表皮細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。
　　(1)最佳病毒感染復(fù)數(shù)的測(cè)定:將攜帶EGF基因和GFP基因的腺病毒(Ad-hEGF)以不同感染復(fù)數(shù)(MOI值分別為0，5，20，50，100，150，200)轉(zhuǎn)

2、染表皮細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24、48、72 h，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染率，ELISA法檢測(cè)收集的細(xì)胞上清液中EGF濃度，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖率，確定最佳的病毒感染復(fù)數(shù)。
　　(2)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分泌EGF生物活性的檢測(cè):將細(xì)胞分為未轉(zhuǎn)染組（對(duì)照組）和轉(zhuǎn)染組。對(duì)照組用未轉(zhuǎn)染的表皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液孵育，轉(zhuǎn)染組用最佳MOI值(50) Ad-hEGF轉(zhuǎn)染后的表皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液孵育，分

3、別于孵育后1、3、5d，CCK-8法檢測(cè)兩組細(xì)胞的增殖率。
　　(3)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的檢測(cè):將細(xì)胞分為未轉(zhuǎn)染組（對(duì)照組）和轉(zhuǎn)染組。對(duì)照組不加Ad-hEGF，轉(zhuǎn)染組用最佳MOI值(50)Ad-hEGF轉(zhuǎn)染表皮細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后，免疫熒光染色法檢測(cè)表皮細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志物CK14、CK19表達(dá)。
　　(4)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力的檢測(cè):將細(xì)胞分為未轉(zhuǎn)染組（對(duì)照組）和轉(zhuǎn)染組。對(duì)照組不加Ad-hEGF，轉(zhuǎn)染組用最佳MOI值

4、(50) Ad-hEGF轉(zhuǎn)染表皮細(xì)胞。于劃痕后0、12、24、48 h，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況。
　　2.細(xì)胞-微粒皮法修復(fù)大鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面的實(shí)驗(yàn)研究
　　取健康清潔級(jí)成年SD大鼠70只，體質(zhì)量210～230 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為7組，每組10只，Ⅰ組:微粒皮(1∶10)移植組，Ⅱ組:微粒皮(1∶20)移植組，Ⅲ組:微粒皮(1∶20)+普通表皮細(xì)胞移植組，Ⅳ組:微粒皮(1∶20)+EGF高表達(dá)的表皮細(xì)胞移植

5、組，Ⅴ組:普通表皮細(xì)胞移植組，Ⅵ組:EGF高表達(dá)的表皮細(xì)胞移植組，Ⅶ組:對(duì)照組。35只Wistar大鼠用于制備異體中厚皮，同時(shí)將70只SD大鼠背部制作大鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面抗攣縮模型。將各組移植物分別移植到相應(yīng)創(chuàng)面，各組均覆蓋由成年Wistar大鼠背部皮膚制備的同種異體中厚皮。
　　(1)創(chuàng)面大體觀察及愈合率的測(cè)定:術(shù)后觀察大鼠存活情況;術(shù)后7d、14d、21d觀察各組大鼠背部同種異體皮成活、脫落及刨面愈合情況，同種異體皮脫落后計(jì)算

6、創(chuàng)面愈合率。
　　(2)創(chuàng)面組織學(xué)的檢測(cè):術(shù)后21 d時(shí)取材行組織學(xué)及免疫組織化學(xué)染色，觀察創(chuàng)面修復(fù)情況。
　　(3)創(chuàng)面組織中EGF mRNA水平的檢測(cè):術(shù)后7d、14d、21 d創(chuàng)面取材行Real-time PCR分析創(chuàng)面組織中EGF mRNA水平。
　　結(jié)果:
　　1.表皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)與功能表皮細(xì)胞的構(gòu)建
　　(1)最佳病毒感染復(fù)數(shù)的測(cè)定:轉(zhuǎn)染后24、48 h，各組表皮細(xì)胞形態(tài)比較無明顯改變，均呈小

7、的多角形，胞體透亮，細(xì)胞核居中較大。轉(zhuǎn)染后72h，MOI=200轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞碎片較其他組明顯增多。對(duì)照組表皮細(xì)胞未見綠色熒光蛋白表達(dá)，而各轉(zhuǎn)染組表皮細(xì)胞可見綠色熒光蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染后72h，MOI=50，100，150，200轉(zhuǎn)染組表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染率均大于90％，對(duì)照組及MOI=5，20轉(zhuǎn)染組表皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率分別為（0.51±0.20）％、（62.44±6.23）％、（75.00±5.43）％，明顯低于MOI=50轉(zhuǎn)染組的(93.12±2.5

8、5)％(P值均小于0.01)。隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長，各轉(zhuǎn)染組表皮細(xì)胞上清液中EGF濃度逐漸增高。轉(zhuǎn)染后72 h，MOI=50轉(zhuǎn)染組表皮細(xì)胞上清液中EGF濃度明顯高于其余各組(P值均小于0.01)。轉(zhuǎn)染后24、48 h，各組表皮細(xì)胞增殖率相近（P值均大于0.05）。轉(zhuǎn)染后72 h，MOI=200轉(zhuǎn)染組表皮細(xì)胞增殖率明顯低于其余各組（P值均小于0.05）。
　　(2)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分泌EGF生物活性的檢測(cè):孵育后1d，轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組表皮細(xì)胞

9、的增殖率相近(P＞0.05)。孵育后3、5d，轉(zhuǎn)染組表皮細(xì)胞增殖率分別為1.10±0.11、1.87±0.21，明顯高于對(duì)照組的0.69±0.09、0.82±0.08(P值均小于0.01)。
　　(3)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的檢測(cè):轉(zhuǎn)染后24 h,轉(zhuǎn)染組表皮細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志物CK14、CK19表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng)。
　　(4)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力的檢測(cè):劃痕后48 h，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞已基本爬滿劃痕，對(duì)照組細(xì)胞仍未爬行至劃痕中心。

10、劃痕后12～48 h，2組細(xì)胞遷移距離比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均小于0.01）。
　　2.細(xì)胞-微粒皮法修復(fù)大鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面的實(shí)驗(yàn)研究
　　(1)創(chuàng)面大體觀察及愈合率的測(cè)定:術(shù)后大鼠均存活至實(shí)驗(yàn)完成。術(shù)后各組大鼠同種異體皮隨時(shí)間延長逐漸成活，干燥并開始脫痂，至同種異體皮基本脫落后Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組創(chuàng)面可見成片上皮，Ⅴ組創(chuàng)面可見菲薄上皮，Ⅵ組殘留大部分創(chuàng)面，Ⅶ組創(chuàng)面無上皮形成。同種異體皮脫落后（術(shù)后21 d時(shí)），Ⅰ、Ⅱ、

11、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ組創(chuàng)面愈合率分別為83.2％±5.6％、66.0％±6.0％、73.6％±5.3％、83.7％±4.3％、36.5％±6.1％、66.5％±5.1％、22.7％±5.5％，Ⅰ、Ⅳ組創(chuàng)面愈合率顯著高于其余各組(P＜0.01)，Ⅲ組創(chuàng)面愈合率高于Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ組(P＜0.05)，Ⅱ、Ⅵ組創(chuàng)面愈合率高于Ⅴ、Ⅶ組(P＜0.01)，Ⅴ組創(chuàng)面愈合率高于Ⅶ組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);Ⅰ、Ⅳ組間創(chuàng)面愈合率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)

12、意義（P＞0.05），Ⅱ、Ⅵ組間創(chuàng)面愈合率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　(2)創(chuàng)面組織學(xué)的檢測(cè):組織學(xué)觀察，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組創(chuàng)面上皮分層明顯，表皮層較厚，基底層呈柱狀排列，Ⅴ、Ⅵ組創(chuàng)面可見表皮層含有較多空泡，且細(xì)胞排列疏松，Ⅶ組為肉茅組織。免疫組織化學(xué)染色觀察，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組表皮-真皮連接層的Ⅳ型膠原表達(dá)呈陽性,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組表皮-真皮連接層的層黏連蛋白表達(dá)呈陽性，Ⅶ組均呈陰性。
　　(3)創(chuàng)面組織

13、中EGF mRNA水平的檢測(cè):術(shù)后7d和14d，Ⅳ和Ⅵ組的EGF mRNA表達(dá)水平顯著高于其他組（P＜0.01）。術(shù)后21 d，EGFmRNA的表達(dá)在所有組幾乎檢測(cè)不到。
　　結(jié)論:
　　1.Ad-hEGF轉(zhuǎn)染表皮細(xì)胞的合適MOI值為50～150，以50為最佳，既能高效表達(dá)目的基因，又可保持良好的細(xì)胞生物學(xué)特性。
　　2.普通表皮細(xì)胞與自體微粒皮聯(lián)合移植可提高創(chuàng)面愈合率，提升自體皮修復(fù)大創(chuàng)面的效率，減少自體皮的使用，為