骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與微粒皮組織促進(jìn)創(chuàng)面愈合的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[研究背景和目的]: 缺乏供皮區(qū)和創(chuàng)面愈合時(shí)間長(zhǎng)是大面積燒傷創(chuàng)面修復(fù)的難題，愈合時(shí)間延長(zhǎng)將使患者機(jī)體長(zhǎng)期處于消耗狀態(tài)，從而抵抗力下降、易于發(fā)生感染和多器官功能衰竭。自從發(fā)明微粒植皮技術(shù)后，利用少量的中厚皮片制成微粒皮顆粒，來消滅大面積的創(chuàng)面成為可能。但微粒皮植皮也有其缺點(diǎn)： 1.生成的皮膚缺乏完整的真皮結(jié)構(gòu)，較薄非常容易破潰，再次形成創(chuàng)面； 2.在微粒皮愈合后創(chuàng)面易產(chǎn)生大量增生瘢痕，影響機(jī)體的外觀和功能；

2、 3.微粒皮本身在創(chuàng)面成活率不確定，有時(shí)難以達(dá)到理想的效果。 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Bonemesenchymalstemcell，BMSCs)是一種成體干細(xì)胞；BMSCs修復(fù)創(chuàng)面的機(jī)制目前認(rèn)為： 1.干細(xì)胞具有自我更新的能力和強(qiáng)大的分化潛能，能對(duì)創(chuàng)傷引起的微環(huán)境的改變，根據(jù)局部修復(fù)的需要分化成所需要的修復(fù)細(xì)胞并整合到局部組織中； 2.在創(chuàng)面局部被激活的BMSCs能夠扮演“微型生物反應(yīng)器”的功能，分泌多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞

3、因子，調(diào)節(jié)局部的細(xì)胞的增殖分化，細(xì)胞基質(zhì)的形成，血管的形成等過程； 3.在機(jī)體受到損傷啟動(dòng)炎癥反應(yīng)過程的同時(shí)，BMSCs能夠在早期遷徙到受損組織參與組織修復(fù)。 所得數(shù)據(jù)將為以下方面提供依據(jù)： 1.BMSCs在新鮮創(chuàng)面扮演怎樣的“微型生物反應(yīng)器”的功能，其增殖、分化的方向以及形成細(xì)胞基質(zhì)的情況是怎樣。 2.在新鮮創(chuàng)面上，BMSCs能否與微粒皮組織黏附發(fā)生侵入、遷徙、增殖并分化，促進(jìn)微粒皮組織的成活。

4、 3.BMSCs與微粒皮組織能否促進(jìn)創(chuàng)面愈合，提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量。 [方法]: 第一部分:F344雄性大鼠BMSCs的體外分離培養(yǎng)及鑒定 1.BMSCs分離、培養(yǎng)、傳代：斷頸處死10～12wF344雄性大鼠，從股骨、脛骨，肱骨中沖洗出骨髓，接種于培養(yǎng)瓶，48h后更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁的細(xì)胞，每隔48h換液，接近融合的BMSCs按1:2比例傳代培養(yǎng)，留取第3代備用。 2.細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)：取3、5代細(xì)胞MTT法

5、測(cè)細(xì)胞增殖活性并繪制細(xì)胞增殖曲線。 3.BMSCs的細(xì)胞周期檢測(cè)：取傳代生長(zhǎng)良好的的第3代細(xì)胞，0.25％胰酶室溫消化后制成細(xì)胞懸液，碘化丙啶染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記：第3代細(xì)胞，0.25％胰酶室溫消化后制成細(xì)胞懸液，取濃度約1×106／mllml分別加入適量FITC標(biāo)記CD29，CD34，CD44，CD90抗體避光染色，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。 5.成脂、成骨誘導(dǎo)分化鑒定：第3代細(xì)胞，

6、加入成骨、成脂誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)油紅“0”、茜蘇紅染色鑒定[6,7]。 第二部分:骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與微粒皮組織移植創(chuàng)面的實(shí)驗(yàn)研究 1.將P5代細(xì)胞用5-BrdU10μmol/L孵育48h標(biāo)記。 2.取Wistar大鼠全厚皮，剪成4×4cm2大小作異體皮用。 3.48只F344雌性大鼠隨機(jī)分為四組：A組骨髓間充質(zhì)細(xì)胞+微粒皮移植組；B組微粒皮移植組；C組BMSCs移植組；D組生理鹽水注射組。在F344大鼠背部形成

7、-4×4cm2創(chuàng)面，留取1／4皮片剪成微粒皮，均勻涂抹在異體皮上，縫合固定創(chuàng)面。 4.于術(shù)后14d打開異體皮，觀察創(chuàng)面愈合情況，統(tǒng)計(jì)創(chuàng)面愈合率，觀察并記錄創(chuàng)面愈合時(shí)間，統(tǒng)計(jì)創(chuàng)面收縮率。 5.在創(chuàng)面愈合的當(dāng)日，處死大鼠，留取標(biāo)本，放入-80℃冰箱保存。 第三部分:骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在創(chuàng)面增殖、分化情況的實(shí)驗(yàn)研究 1.原位雜交冰凍切片行大鼠Sry基因標(biāo)記，光學(xué)顯微鏡下檢查。 2.免疫熒光組織化學(xué)染色冰凍切

8、片進(jìn)行BrdU、FⅧ、Keratin、Actin、Nestin、S-100免疫熒光組織化學(xué)染色，熒光顯微鏡下觀察。 [結(jié)果]: 第一部分:BMSCs的分離培養(yǎng)擴(kuò)增及鑒定 1.全骨髓細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶后，24h體外培養(yǎng)有少量貼壁細(xì)胞，大量的懸浮細(xì)胞，48h后棄去懸浮細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)，在96h換液后見懸浮細(xì)胞減少，細(xì)胞呈克隆樣生長(zhǎng)，10d左右達(dá)到細(xì)胞融合，基本上沒有懸浮細(xì)胞。 2.細(xì)胞周期：碘化丙啶染色，流式

9、細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：MSCs中的S+G2+M細(xì)胞約占20.19％，而處于G0／G1期的細(xì)胞為79.81％，大多數(shù)為合成期細(xì)胞，只有少數(shù)的細(xì)胞處于活躍的增殖期。 3.BMSCs表面標(biāo)記的鑒定：CD29細(xì)胞陽性率為79.15％，CD34細(xì)胞陽性率為9.10％，CD44細(xì)胞陽性率為89.47％，CD90細(xì)胞陽性率為72.34％。 4.BMSCs成脂、成骨分化潛能的鑒定：成脂誘導(dǎo)14d油紅“0”染色，細(xì)胞內(nèi)可見細(xì)小脂滴形成，21

10、d脂滴融合成片；成骨誘導(dǎo)14d茜蘇紅染色，可見少量鈣鹽沉淀，21d細(xì)胞間可見致密的、圓形、成片狀的棕紅團(tuán)塊，面積較大。 第二部分:骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與微粒皮組織移植創(chuàng)面的實(shí)驗(yàn)研究 1.創(chuàng)面愈合率：傷后14d打開異體皮，A組創(chuàng)面已基本愈合，創(chuàng)面愈合率為85.77±3.47％：B組創(chuàng)面愈合率為62.16±4.39％；C組、D組創(chuàng)面為肉芽創(chuàng)面，創(chuàng)面愈合率分別為30.41±1.73％，29.96±1.33％，創(chuàng)面的愈合是因?yàn)閯?chuàng)面的收

11、縮。Welch=1028.700，P<0.001，A、B兩組比較有顯著性差異P<0.001，C、D兩組比較沒有顯著性差異，P=0.898。 2.創(chuàng)面愈合時(shí)間：A組的創(chuàng)面愈合時(shí)間為17.17±1.64；B組為20.33±2.38：C組為23.08±1.31；D組為25.16±1.53.F=46.372，P<0.001，A、B兩組比較有顯著性差異P<0.001，C、D兩組比較有顯著性差異，P=0.006。 3.創(chuàng)面收縮率：A

12、組的創(chuàng)面收縮率為36.89±1.94％；B組為39.56±2.93％；C組為92.15±1.44％；D組為92.40±1.91％；F=2608.977，P<0.001，A、B兩組比較有顯著性差異P<0.01，C、D兩組比較沒有顯著性差異，P=0.903. 第三部分:骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在創(chuàng)面增殖、分化情況的實(shí)驗(yàn)研究 1.原位雜交：A組微粒皮標(biāo)本切片上，在毛囊的周圍可見較多的，細(xì)胞核為棕色的細(xì)胞，真皮層內(nèi)可見散在的核為棕色的細(xì)胞

13、。C組標(biāo)本在愈合瘢痕組織內(nèi)可見散在的核為棕色的細(xì)胞。B組、D組標(biāo)本未見核為棕色的細(xì)胞。 2.免疫組化雙熒光染色： 1)A組標(biāo)本可見較強(qiáng)的標(biāo)記BrdU的紅色熒光和Keratin的綠色熒光出現(xiàn)在毛囊周圍，并且位于同一位置；B組標(biāo)本可見較強(qiáng)的綠色熒光位于上皮基底層，但未見到相應(yīng)BrdU標(biāo)記的紅色熒光。D組標(biāo)本未見兩種顏色的熒光。 2)A組與C組在真皮層內(nèi)可見血管樣結(jié)構(gòu)的標(biāo)記BrdU的紅色熒光和FⅧ的綠色熒光位于同一位置

14、；B組標(biāo)本在真皮層內(nèi)可見散在的綠色熒光，D組標(biāo)本在愈合瘢痕組織可見散在的綠色熒光，但兩組均未見相應(yīng)的標(biāo)記BrdU的紅色熒光出現(xiàn)。 3)A、C兩組在真皮層內(nèi)可見散在的標(biāo)記BrdU的紅色熒光和Actin的綠色熒光位于同一位置；B組標(biāo)本在真皮層內(nèi)可見散在的綠色熒光，D組標(biāo)本在愈合瘢痕組織可見散在的綠色熒光，但兩組均未見相應(yīng)的標(biāo)記BrdU的紅色熒光出現(xiàn)。 4)A、C兩組在真皮層內(nèi)可見散在的標(biāo)記BrdU的紅色熒光和Nestin的綠

15、色熒光位于同一位置。B、D組標(biāo)本未見兩種顏色的熒光。 5)A、C兩組在真皮層內(nèi)可見散在的標(biāo)記BrdU的紅色熒光和Nestin的綠色熒光位于同一位置。B、D組標(biāo)本未見兩種顏色的熒光。 [結(jié)論]: 1.成功地從大鼠骨髓中分離出BMSCs，并證實(shí)分離的BMSCs具有多項(xiàng)分化潛能，符合成體干細(xì)胞的特性 2.移植創(chuàng)面的BMSCs能促進(jìn)微粒皮組織成活，并促進(jìn)創(chuàng)面愈合 3.移植于創(chuàng)面的BMSCs在創(chuàng)面及微粒皮組