P物質(zhì)聯(lián)合表皮干細(xì)胞促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合與神經(jīng)再生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討糖尿病大鼠表皮干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的方法及其生物特性，觀察P物質(zhì)聯(lián)合表皮干細(xì)胞對糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合與神經(jīng)再生的影響，為糖尿病創(chuàng)面的修復(fù)提供一種新技術(shù)方法，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　 方法：⑴SD大鼠隨機(jī)分成糖尿病組和正常對照組。糖尿病組采用一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ，65 mg/kg)制備糖尿病大鼠模型，正常對照組不作處理。分別取成模糖尿病和正常大鼠背部全層皮膚，采用胰

2、蛋白酶和乙二胺四乙酸聯(lián)合消化法分離表皮，Ⅳ型膠原黏附法純化培養(yǎng)表皮干細(xì)胞。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化和細(xì)胞克隆形成，細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制生長曲線，計(jì)算克隆形成率，免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定K19、β1-integrin陽性表達(dá)，圖像分析軟件測定陽性細(xì)胞的積分吸光度(IA)值。⑵取成功建模的糖尿病大鼠48只，于背部脊柱兩側(cè)以特制打孔器致直徑1.8cm全層皮膚缺損創(chuàng)面，每只大鼠四個(gè)創(chuàng)面用隨機(jī)抽簽法隨機(jī)分為四組(A組：表皮干細(xì)胞+P物質(zhì)組；B組：表

3、皮干細(xì)胞組；C組：P物質(zhì)組；D組：單純羊膜對照組)其中A、B兩組分別用羊膜負(fù)載的表皮干細(xì)胞移植修復(fù)；A、C兩組分別于移植后在創(chuàng)周及創(chuàng)中注射10-7mol/L的P物質(zhì)250μl，B組和D組同等條件下注射P物質(zhì)溶劑作對照，每日2次，連用4天。動(dòng)態(tài)觀察各組創(chuàng)面愈合情況；創(chuàng)面組織HE染色觀察組織學(xué)變化；免疫組織化學(xué)Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、PGP9.5和P物質(zhì)染色觀察創(chuàng)面膠原變化與創(chuàng)面神經(jīng)再生情況。
　　 結(jié)果：①糖尿病組大鼠表皮干細(xì)胞原代貼

4、壁數(shù)量較少，其克隆形成率為7.43％±1.21％，明顯低于正常對照組的15.37％±2.03％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。兩組表皮干細(xì)胞的K19、β1-integrin均呈陽性表達(dá)，糖尿病組陽性細(xì)胞的IA值分別為86.17±10.54、26.35±7.63，均低于正常對照組的160.31±36.52、59.46±14.67，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。②與B、C和D組相比較，A組創(chuàng)面愈合時(shí)間明顯縮短，皮膚組織中Ⅰ型、Ⅲ型

5、膠原含量明顯增多。A、C兩組創(chuàng)面組織中有大量PGP9.5和P物質(zhì)陽性表達(dá)神經(jīng)纖維再生，部分神經(jīng)纖維末梢向表皮延伸接近表皮組織。B、D組僅見創(chuàng)面組織深層有少量PGP9.5和P物質(zhì)陽性神經(jīng)纖維組織表達(dá)，未見神經(jīng)纖維末梢向表皮延伸。
　　 結(jié)論：⑴在本培養(yǎng)體系條件下能成功的分離培養(yǎng)糖尿病大鼠表皮干細(xì)胞，其體外增殖能力較正常皮膚增殖能力弱，可能是導(dǎo)致糖尿病創(chuàng)面難愈的重要因素之一。⑵聯(lián)合應(yīng)用外源性SP和表皮干細(xì)胞可有效促進(jìn)糖尿病糖尿病創(chuàng)面