T細胞非霍奇金淋巴瘤基因重排及T細胞相關細胞因子受體表達模式的研究.pdf

1、淋巴瘤的病理診斷被公認為是臨床病理中難度最大的,僅靠組織形態(tài)學以及免疫組化結(jié)果有時容易造成誤診及漏診。隨著分子生物學的發(fā)展,分子克隆分析無論是在淋巴瘤的初次診斷還是以后的隨訪中日益重要并且逐漸成熟,國外,特別是免疫球蛋白基因的克隆分析,已經(jīng)用于B細胞非霍奇金淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin lymphoma,B-NHL)的常規(guī)病理診斷。T細胞非霍奇金淋巴瘤(T-cell non-Hodgkin iymphoma,T-NHL)

2、是一種相對較少見且高度異質(zhì)性的惡性淋巴瘤,目前國內(nèi)外對T-NHL的病理診斷還不太樂觀。T-NHL的病理診斷要解決兩個問題,一是不是T-NHL?二是哪一種類型的T-NHL?也就是T-NHL的診斷和分類問題。關于第一個問題,由于T-NHL其形態(tài)多變以及免疫學上無克隆性標記,主張對所有的T細胞增殖性疾病進行分子克隆性基因重排分析,尤其是T細胞富裕的B細胞非霍奇金淋巴瘤?？寺》治隽馨土龅脑硎腔谒袗盒粤馨图毎加幸粋€共同的克隆起源。目前淋巴

3、瘤的分子病理診斷中,聚合酶鏈反應技術(polymerase chain reaction,PCR)因其快速、簡單、高效、廉價,敏感度高以及對DNA的質(zhì)和量要求不高等優(yōu)點而逐步取代了Southern blot。一般來說,PCR檢測的高靈敏度期望是從新鮮的或冰凍的樣本中分離得到DNA,而從福爾馬林固定石蠟包埋(formalin fixed and paraffin embedded,FFPE)的組織樣本中分離得到的DNA使其敏感性有所降低。

4、不幸的是,在大部分的診斷病例以及回顧性研究中,僅能得到FFPE的組織樣本。從FFPE的組織樣本中分離出的DNA含有許多斷裂的并伴有化學修飾的短小靶序列,不利于分子診斷。如何提高FFPE樣本檢測的敏感性是研究者面對的一個難題。另一方面不同文獻中所選擇的引物,PCR循環(huán)參數(shù)以及PCR產(chǎn)物分析方法都不盡相同,檢測結(jié)果也有差異。因此,如何找到適合于常規(guī)臨床病理診斷的標準程序是研究者面對的另一個難題。實際上與新鮮的或冰凍的樣本相比,克隆分析FFP

5、E樣本的難度在于需要更多的實驗,本研究獲省科技廳項目(001110425)、浙江省自然科學基會項目(Y205292)和浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學研究基金(2006A084)資助其與大部分的體細胞基因PCR擴增相比更為復雜。以PCR為基礎的克隆分析雖不是一項新穎的方法,但現(xiàn)有發(fā)表的文章很少有改變PCR參數(shù)擴增FFPE樣本的DNA模板的研究分析。關于第二個問題,分化標記物表達的研究表明大多數(shù)T-NHL是由胸腺后T細胞的惡性轉(zhuǎn)化發(fā)展而來的,因此這些惡

6、性腫瘤被稱為外周T細胞淋巴瘤(periferal T celllymphomas,PTCLs)。PTCLs一群高度異質(zhì)性的惡性淋巴瘤,其診斷、分類及分子發(fā)病機制的研究一直是腫瘤病理學中最為困難和最有爭議的領域之一。最新的2001年WHO分類標準,已經(jīng)分化出了一些獨立存在的腫瘤實體,如腸病相關性T細胞淋巴瘤(enteropathy type T cell lymphoma,ETTCL),間變性大細胞性T細胞淋巴瘤(anaplasticla

7、gre T cell lymphoma,ALCL),血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤(angioimmunoblastic T-celllymphoma,AITL),鼻型T/NK細胞淋巴瘤以及肝脾γδT細胞淋巴瘤等等,除此之外,一種新PTCLs被分出,即非特指外周T細胞淋巴瘤(periferal T cell lymphomas,unspecified,PTCL-U),然而這一術語僅用來描述一類異質(zhì)性的淋巴瘤,而這類淋巴瘤有不同的臨床特征,組

8、織學特點,基因改變,治療反應以及相應的預后。因此,詳細的PTCLs分類,尤其是PTCL-U有待于進一步的澄清。迄今為止,T-NHL的分類大致基于形態(tài)學或臨床準則。最近研究表明,正常T細胞亞群趨化因子受體的表達模式與該細胞亞群分泌的細胞因子相關,CCR3選擇性表達在人類或小鼠的Th2細胞,CXCR3選擇表達在Th1細胞。基于以上原因,本實驗以FFPE中T細胞受體(TCR)γ基因重排為研究對象,選用TCR多重引物,通過優(yōu)化DNA提取以及PC

9、R多個參數(shù)分析T-NHL中TCRγ基因重排,以建立PCR擴增中不同變量性能改變的重要意義。另選用一對TCRβ通用性引物作為TCRγ多重引物的補充和比較,同時聯(lián)合最常用以及檢測率較高的FR3A和FR2A通用性引物檢測T-NHL中IgH基因的克隆性重排在本實驗室T-NHL中的檢測率。我們研究趨化因子受體中Th1相關標記CXCR3和Th2細胞相關標記CCR3在T-NHL中表達以評估其與臨床病理的關系。材料與方法1材料(1)T-NHL標本:收集

10、1997-2008年我醫(yī)學院附屬醫(yī)院及省內(nèi)其它醫(yī)院的T-NHL標53例。全部標本經(jīng)中性福爾馬林固定、常規(guī)石蠟包埋、4～5μm連續(xù)切片,除常規(guī)HE染色外,采用LCA(2B11,DAKO)、CD45RO(UCHL1,DAKO)、CD20(L26,DAKO)、CD30(Ber-H2,DAKO)免疫組化確定腫瘤的免疫表型。按照2001年WHO關于淋巴及造血系統(tǒng)腫瘤分類標準對所有病例進行分類:同時參照1992年Kail標準進行組織學高低級別分級。

11、(2)對照組標本:收集反應性增生的淋巴組織石蠟標本4例,其中1例為淋巴結(jié),3例為扁桃體。(3)Jurkat細胞:人類T細胞白血病細胞株,培養(yǎng)條件:選擇RPMI1640(含10％胎牛血清)培養(yǎng)基,放入37℃,5%CO2～95%空氣飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。待細胞生長接近融合成簇,離心收集后待用。2方法(1)免疫組織化學檢測T-NHL中LCA,CD45RO,CD20,CD30的表達,確定腫瘤免疫表型。(2)選取6例T-NHL和4例反應性增生的淋

12、巴組織,根據(jù)脫蠟時間與脫蠟溫度不同分為兩組,然后常規(guī)蛋白酶K-酚氯仿法抽提石蠟組織DNA;TCRγ基因重排為研究對象,選用多重TCRγ引物,優(yōu)化PCR循環(huán)參數(shù)。(3)采用PCR方法,聯(lián)合TCRγ,TCRβ及FR3A、FR2A引物,檢測53例T-NHL標本TCRγ、TCRβ及IgH基因克隆性重排,產(chǎn)物先2%瓊脂糖電泳初篩,后行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。(4)選擇Th1相關的細胞因子受體CXCR3和Th2相關的細胞因子受體CCR3,

13、運用免疫組化方法檢測這兩種細胞因子受體在45例T-NHL中表達水平,評估其與臨床病理的關系。(5)統(tǒng)計學處理:實驗結(jié)果均使用SPSS16.0 for Windows軟件包進行統(tǒng)計分析。3結(jié)果(1)根據(jù)免疫組織化學分型、組織學改變以及臨床資料,同時參照2001年WHO關于淋巴及造血系統(tǒng)腫瘤分類標準對53例T細胞淋巴瘤進行分類,分為27例外周T細胞淋巴瘤,非特指(PTCL-U),12例腸病相關性T細胞淋巴瘤(ETTCL),8例間變性大細胞T

14、細胞淋巴瘤(ALCL),6皮下脂膜炎性T細胞淋巴瘤(SCPTCL)。(2)脫蠟時間長和脫蠟溫度高的一組DNA質(zhì)量以及產(chǎn)量較高。(3)FFPE樣本TCRγ多重引物擴增中:TCRγA,B管40個循環(huán)達到最佳擴增效果;TCRγA管退貨溫度在50.9℃～65.5℃都可達到滿意的擴增效果,而TCRγB管則需在50.9℃～56.7℃;TCRγA,B管所需引物量50pmol以上,Mg2+終濃度1.25～1.75 mM,dNTPs終濃度100～200

15、uM。(4)53例T-NHL中。采用優(yōu)化的TCRγA,B管多重引物克隆性TCRγ基因重排檢測率為62.3%(33/53),TCRβD2-J2通用性引物的檢洲率為41.9%(23/53),聯(lián)合TCRβ通用性引物,總檢測率為66.0%(35/53)。(5)聯(lián)合TCRγA,B管及FR3A、FR2A引物,7.6%(4/53)T-NHL檢測到雙重重排,免疫組化結(jié)果提示這4例均為T細胞表型。病理類型分別為3例外周T細胞淋巴瘤,非特指(PTCL-U)

16、與1例間變形性大細胞性T細胞淋巴瘤(ALCL)。(6)免疫組化檢測45例T-NHL中CXCR3與CCR3表達水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCR3與CCR3總的表達率為24.4%,不同病理類型之間表達無顯著性差異(P>0.05)。4結(jié)論(1)延長脫蠟時間以及提高脫蠟溫度有助于提高FFPE樣本中DNA的質(zhì)量和產(chǎn)量。(2)對TCRγ多重引物增加PCR循環(huán)次數(shù)有助于提高劣質(zhì)DNA的擴增率,增加引物濃度,輕微增加的Mg2+濃度結(jié)合標準量dNTPs可以改善TC

17、Rγ基因的克隆檢測。(3)在TCRG多重引物優(yōu)化過程中,我們的實驗有助于確定哪一個參數(shù)以及如何改變來減少假陽性或假陰性。(4)采用優(yōu)化的TCRγA,B管多重引物,克隆性TCRγ基因重排在T-NHL中檢測率高于TCRβ通用性引物D2-J2,但聯(lián)合TCRβ通用性引物D2-J2,可以提高總檢測率。(5)基因重排與淋巴瘤細胞的免疫表型并不一致。不能通過基因重排來確定T、B細胞系來源,除非必須同時進行Ig和TCR基因重排,排除其一才能確定其細胞系