B淋巴細(xì)胞刺激因子對(duì)B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控的研究.pdf

1、研究背景及目的：B淋巴細(xì)胞刺激因子（B lymphocyte stimulator，BLyS）是一種與免疫相關(guān)的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，體外實(shí)驗(yàn)證明，BLyS作為一種B淋巴細(xì)胞的共刺激因子，在anti-IgM或CD40L的預(yù)刺激下，可以對(duì)B細(xì)胞有強(qiáng)烈的促進(jìn)增殖和刺激分泌免疫球蛋白的作用，在體液免疫中具有重要作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，BLyS缺陷或過度表達(dá)均能引起機(jī)體的免疫失衡，誘發(fā)多種疾病。目前關(guān)于BLyS與人免疫性疾病，尤其是與B細(xì)胞惡性腫瘤形成和發(fā)

2、展關(guān)系的研究尚處于起步階段，正成為其診斷和治療研究的一個(gè)新熱點(diǎn)。本研究中，用BLyS處理人淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞后，應(yīng)用MTT法、流式細(xì)胞技術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)等方法，分析BLyS對(duì)B淋巴瘤細(xì)胞增殖、化療藥物誘導(dǎo)的凋亡及凋亡相關(guān)通路（NF-KB、JNK、P38）的影響；探討B(tài)LyS在B淋巴瘤細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控中的作用及可能的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、MTT法檢測(cè)BLyS在Raji細(xì)胞增殖中的作用：體外培養(yǎng)人淋巴瘤細(xì)胞株

3、Raji，采用四甲基偶氮唑藍(lán)（tetrzolium-based colorimetric assay，MTT）比色法檢測(cè)（1）BLyS不同濃度組（0.25μg/ml，0.5μg/ml，1μg/ml，）、不同時(shí)間組（24h，48h，72h）對(duì)Raji細(xì)胞增殖的影響。（2）BLyS不同濃度組（0.25μg/ml，0.5μg/ml，1μg/ml，）、不同時(shí)間組（24h，48h，72h）和共刺激分子anti-IgM共同作用對(duì)Raji細(xì)胞增殖的影

4、響。
　　 2、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BLyS對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡的影響：實(shí)驗(yàn)組加入相同濃度的VP-16（0.5μg/ml）和不同濃度（0.25μg/ml，0.5μg/ml和1μg/ml）的BLyS，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BLyS對(duì)VP-16誘導(dǎo)的Raji細(xì)胞凋亡的影響。
　　 3、應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法定性觀察BLyS影響化療藥物誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡過程中NF-KB、JNK、P38蛋白表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：

5、r>　　 1、體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（MTT）結(jié)果顯示，BLyS對(duì)人淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞具有明顯的促增殖作用。不同濃度（0.25μg/ml，0.5μg/ml和1μg/ml）BLyS處理Raji細(xì)胞24～72h后，與對(duì)照組相比，各處理組OD值均有不同程度增大，差異有顯著性（p<0.05）。且隨著BLyS濃度的增加、作用時(shí)間的延長(zhǎng)，OD值逐漸增大。即BLyS對(duì)Raji細(xì)胞的促增殖作用呈明顯的劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)依賴關(guān)系。不同濃度（0.25

6、μg/ml，0.5μg/ml和1μg/ml）的BLyS和anti-IgM（10μl）共同作用也能促進(jìn)Raji細(xì)胞增殖，差異有顯著性（p<0.05）。將相同濃度的BLyS單獨(dú)作用組與anti-IgM共同作用組兩兩比較發(fā)現(xiàn)：當(dāng)BLyS濃度為0.25μg/ml時(shí)兩組在24h、48h、72h時(shí)對(duì)B細(xì)胞的增殖作用無明顯差異（p>0.05）。當(dāng)BLyS濃度為0.50μg/ml、1.00μg/ml時(shí)與單獨(dú)加入BLyS相比，anti-IgM共同作用組，

7、B細(xì)胞的增殖幅度更大，差異有顯著性（p<0.05）。說明BLyS與anti-IgM在刺激B淋巴細(xì)胞增殖上具有協(xié)同性作用。
　　 2、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：Raji細(xì)胞經(jīng)化療藥物VP-16處理48小時(shí)后，流式細(xì)胞儀測(cè)得典型的亞二倍體凋亡峰，當(dāng)加入VP-16同時(shí)加入BLyS后，細(xì)胞凋亡受到明顯抑制，且隨著BLyS濃度的增加，凋亡率逐漸降低。當(dāng)BLyS的濃度為0μg/ml，0.25μg/ml，0.5μg/ml和1μg/ml時(shí)，Raj

8、i細(xì)胞凋亡率分別為18.32％，14.56％，7.39％，3.28％。說明BLyS能夠抑制化療藥物VP-16誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，且抑制作用呈明顯的劑量依賴性。
　　 3、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：對(duì)照組Raji細(xì)胞中NF-κB染色強(qiáng)度呈弱陽性，彌漫分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。與對(duì)照組相比，單獨(dú)加入VP-16，NF-κB表達(dá)無明顯變化，當(dāng)加入VP-16同時(shí)加入BLyS后，陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加，核染色強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。對(duì)照組Raji中JNK、P3

9、8染色強(qiáng)度呈弱陽性，彌漫分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核；VP-16處理后細(xì)胞核染色強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，陽性細(xì)胞數(shù)增加，當(dāng)加入化療藥物同時(shí)加入BLyS，與單獨(dú)加入化療藥物VP-16組相比，細(xì)胞染色強(qiáng)度減弱，陽性細(xì)胞數(shù)減少。
　　 結(jié)論：
　　 1、BLyS促進(jìn)人淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞增殖，且anti-IgM與BLyS在刺激B淋巴瘤細(xì)胞增殖上具有協(xié)同性作用。
　　 2、BLyS抑制化療藥物VP-16誘導(dǎo)的Raji細(xì)胞凋亡。