應(yīng)用葉酸受體靶向納米載體增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞光動力殺傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、卵巢癌發(fā)病率居婦科惡性腫瘤第二位，病死率居婦科腫瘤首位。由于其起病隱匿，早期患者通常無癥狀且缺乏有效的早期診斷與篩查手段，大多數(shù)患者明確診斷時已屆晚期(FIGO stageⅢ-Ⅳ)。晚期患者的主要治療方式為手術(shù)及術(shù)后輔助化療。遺憾的是盡管近幾十年來手術(shù)技術(shù)不斷進(jìn)步，新型化療藥物亦不斷應(yīng)用于臨床，晚期卵巢癌患者的生存率至今仍無明顯改善。因此尋求新的有效的輔助治療手段，應(yīng)用于晚期卵巢癌綜合治療，以期改善預(yù)后，提高患者生活質(zhì)量，是當(dāng)前的研究熱

2、點(diǎn)。光動力治療(Photodynamic therapy, PDT)作為一種新興的腫瘤選擇性治療方法，目前已經(jīng)應(yīng)用于臨床喉癌等腫瘤的姑息治療，且可以與其它抗腫瘤治療聯(lián)合應(yīng)用，顯示出較好的臨床應(yīng)用前景。光動力治療的核心要素是光敏劑(Photosensitizers，Ps)，一代光敏劑為混合物，毒性較大;二代純化的光敏劑目前在臨床上已有應(yīng)用;在二代光敏劑的基礎(chǔ)上加以特殊修飾成為三代光敏劑，以提高腫瘤靶向性，是光動力學(xué)研究的未來發(fā)展方向。21

3、世紀(jì)以來，納米科技迅猛發(fā)展，納米醫(yī)藥有望在醫(yī)療領(lǐng)域取得革命性突破。以納米載體作為給藥系統(tǒng)能提高藥物功效，降低毒性，且具有腫瘤靶向性，與傳統(tǒng)給藥方式相比具有獨(dú)特的優(yōu)勢。葉酸受體在大多數(shù)腫瘤中高表達(dá)，因此葉酸可作為靶向分子修飾納米載體，實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向治療。本課題基于上述學(xué)科前沿進(jìn)展，擬制備葉酸修飾的納米載體，攜帶光敏劑實(shí)現(xiàn)卵巢癌靶向光動力學(xué)治療。本研究主要內(nèi)容包括以兩親性共聚物聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)-聚乳酸

4、(Polylactic acid, PLA)為材料，連接靶向基團(tuán)葉酸分子(Folic acid，F(xiàn)A)，制備攜帶國產(chǎn)二代光敏劑竹紅菌乙素(Hypocrellin B，HB)的葉酸受體靶向的嵌段共聚物納米載體，探索其制備工藝，檢測其主要理化性質(zhì);之后進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證葉酸分子修飾的納米載體對卵巢癌細(xì)胞的體外靶向性，進(jìn)一步驗(yàn)證該納米載體介導(dǎo)的PDT對卵巢癌細(xì)胞系的殺傷效果。
　　第一部分、葉酸受體靶向納米載體的制備及性質(zhì)測定

5、　　目的：以兩親性共聚物聚乳酸-聚乙二醇(PEG-PLA)及連接葉酸分子的聚乳酸-聚乙二醇(FA-PEG-PLA)為材料，制備PEG-PLA和FA-PEG-PLA兩種嵌段共聚物納米載體，進(jìn)一步在兩種納米載體上攜帶光敏劑HB，探索其制備工藝，并進(jìn)行理化性質(zhì)檢測，評估其后續(xù)研究可行性。
　　方法：
　　用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)透析法制備攜帶HB的PEG-PLA及FA-PEG-PLA嵌段共聚物納米載體溶液。去除溶液中游離的HB后，分別用透射電鏡

6、和動態(tài)光散射儀測得兩種納米載體的大小及粒徑分布。室溫下放置一星期，觀察有無游離藥物釋放出來。在兩種納米載體溶液中加入等量甲醇，破乳后濾器過濾，濾液進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析，測得納米載體攜帶HB的含量，計算包封率及載藥量。將制備的納米載體溶液真空冷凍干燥后備用。
　　結(jié)果：
　　成功制備PEG-PLA及FA-PEG-PLA兩種嵌段共聚物納米載體，并成功包裹HB。兩種納米載體粒子均呈球形，粒徑分布較一致，分散性好。PEG

7、-PLA納米載體的平均粒徑為156.9nm，F(xiàn)A-PEG-PLA納米載體平均粒徑為174.0nm。HB-PEG-PLA納米載體的包封率為96％，載藥量為1.28％，而HB-FA-PEG-PLA納米載體包封率為78.1％，載藥量為1.04％。納米載體凍干粉劑復(fù)溶后仍能保持其原有理化性質(zhì)。
　　結(jié)論：
　　成功制備攜帶HB的PEG-PLA及FA-PEG-PLA兩種嵌段共聚物納米載體。兩種納米載體性質(zhì)穩(wěn)定，包封率及載藥量均符合體外

8、細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)要求，可以用于后續(xù)研究。
　　第二部分、應(yīng)用葉酸受體靶向納米載體增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞光動力殺傷的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：驗(yàn)證葉酸受體靶向納米載體對差異表達(dá)葉酸受體的卵巢癌細(xì)胞的靶向作用，并探討攜帶HB的納米載體對兩種卵巢癌細(xì)胞的殺傷作用及殺傷機(jī)制。
　　方法：
　　設(shè)計葉酸受體引物，用定量PCR檢測卵巢癌細(xì)胞系SKOV3及HO8910葉酸受體的表達(dá)。將上述兩種納米載體與細(xì)胞共同孵育，設(shè)置不同孵育時間(0.5、1及

9、2 h)或葉酸含量（0、5％及10％），在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度，驗(yàn)證細(xì)胞對納米載體的靶向性攝入。用MTT法檢測HO8910細(xì)胞在不同HB劑型(游離HB、HB-PEG-PLA及HB-FA-PEG-PLA)、不同HB濃度(1、2、3和4ug/m)及不同激光強(qiáng)度(0、0.5、1及2J/cm2)光動力學(xué)照射后的相對存活率。在同一激光強(qiáng)度(2J/cm2)照射下，MTT法檢測SKOV3及HO8910細(xì)胞在不同劑型(游離HB、HB-PEG-P

10、LA及HB-FA-PEG-PLA)及不同HB濃度(1、2、3和4ug/ml)PDT照射后的相對存活率。Annexin-Ⅴ-FITC/PI雙染后通過流式細(xì)胞儀檢測兩種細(xì)胞系PDT照射后細(xì)胞凋亡率及壞死率。
　　結(jié)果：
　　1.定量PCR測得HO8910細(xì)胞的葉酸受體表達(dá)量明顯高于SKOV3(1.019±0.211 vs0.126±0.016,P＜0.01)。
　　2.在一定范圍內(nèi)，細(xì)胞與兩種納米載體孵育時間越長，細(xì)胞內(nèi)光

11、敏劑熒光強(qiáng)度就越強(qiáng)(P＜0.05）。含F(xiàn)A-PEG-PLA的細(xì)胞比PEG-PLA細(xì)胞熒光強(qiáng)度高（P＜0.01）。HO8910與SKOV3相比，其細(xì)胞內(nèi)HB-FA-PEG-PLA的熒光強(qiáng)度在無葉酸組(99.104±2.979 vs94.651±2.173，P=0.027)、5％葉酸組(107.502±1.992 vs98.427±1.369，P＜0.01)及10％葉酸組(111.038±5.528 vs102.416±2.493，P=0.

12、013)都要高。HO8910細(xì)胞中10％葉酸的納米載體熒光強(qiáng)度與5％葉酸組無差別(111.0378±5.528 vs107.502±1.992，P=0.215)，而SKOV3細(xì)胞中兩者有差別(102.416±2.493 vs98.427±1.369，P＜0.01)。葉酸含量再增加，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)不明顯。葉酸含量為10％時細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，此含量適合后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　3.HO8910細(xì)胞接受光動力學(xué)處理后，能量在2J/cm2，濃度2u

13、g/ml時 HB-FA-PEG-PLA組細(xì)胞相對存活率低于游離HB組(0.222±0.027 vs0.457±0.030，P＜0.01)及HB-PEG-PLA組(0.222±0.027 vs0.344±0.066，P=0.010)，這時條件最合適;在其他參數(shù)時FA-PEG-PLA與PEG-PLA及游離HB的殺傷效應(yīng)差別不理想。說明納米載體介導(dǎo)的殺傷具有能量及濃度的依賴性。不同細(xì)胞在相同能量條件下接受HB-FA-PEG-PLA介導(dǎo)的光動力

14、學(xué)處理，HO8910組與SKOV3組相比，其相對存活率在2ug/ml(0.113±0.038vs0.376±0.091，P＜0.01)、3ug/ml(0.086-0.027 vs0.284±0.099,P=0.022)及4ug/ml(0.056±0.011 vs0.120±0.067,P=0.007)時均較低，說明高表達(dá)葉酸受體的細(xì)胞對HB-FA-PEG-PLA介導(dǎo)的光動力學(xué)殺傷效果更為明顯。
　　4.流式細(xì)胞儀檢測顯示HO891

15、0細(xì)胞與游離HB、HB-PEG-PLA及HB-FA-PEG-PLA作用并接受光照射后凋亡率分別為75.55％，61.95％及64.53％;SKOV3與游離HB、HB-PEG-PLA及HB-FA-PEG-PLA作用并接受光照射后凋亡率分別為63.38％，41.68％及49.82％?？梢奌B主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來殺傷細(xì)胞。HO8910細(xì)胞接受HB-FA-PEG-PLA介導(dǎo)的光動力學(xué)處理后細(xì)胞早期凋亡率與HB-PEG-PLA組無區(qū)別(24.2

16、32±1.225 vs23.324±4.512，P=0.753); SKOV3細(xì)胞中HB-FA-PEG-PLA早期凋亡率比HB-PEG-PLA組高(17.284±1.935 vs10.744±1.253，P=0.008)。但HB-FA-PEG-PLA介導(dǎo)的光動力學(xué)處理后HO8910細(xì)胞凋亡率高于SKOV3組(24.232±1.225 vs17.284±1.935，P=0.006)。
　　結(jié)論：
　　葉酸修飾的嵌段共聚物納米載