TOFA抑制卵巢癌細胞增殖活性及其機制的實驗研究.pdf

1、第一部分:乙酰輔酶A羧化酶A在上皮性卵巢癌組織中的表達及其意義
　　目的:
　　檢測正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織及上皮性卵巢癌組織中乙酰輔酶A羧化酶A(AcetylCoaCarboxylaseA，ACCA)中的表達及其意義。
　　方法:
　　RT-PCR和Real-timePCR方法檢測DNA水平各種卵巢組織中ACCA的表達。
　　結果:
　　正常卵巢組織中ACCA的相對表達含量為7.35±12.2

2、1％，良性卵巢腫瘤組織中ACCA的相對表達含量為39.76±14.87％，上皮性卵巢癌組織中ACCA的平均相對表達含量為42.86±13.44％，和正常卵巢組織相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，良性卵巢腫瘤組織和上皮性卵巢組織相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　結論:
　　良性卵巢腫瘤和上皮性卵巢癌組織中ACCA的表達明顯高于正常卵巢組織，說明卵巢腫瘤組織中存在ACCA過表達，可能成為預測卵巢腫瘤的有效分子指標。

3、
　　第二部分:TOFA抗卵巢癌細胞增殖活性及機制
　　目的:
　　探討乙酰輔酶A羧化酶抑制劑TOFA對上皮性卵巢癌細胞及順鉑耐藥亞株增殖效應、細胞周期及細胞凋亡的影響及其分子機制。
　　方法:
　　應用細胞增殖活性檢測試劑盒(CCK-8)檢測TOFA對上皮性卵巢癌細胞COG1及順鉑耐藥細胞株COC1/DDP增殖抑制效應，流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡的情況，Werternblot方法檢測TOFA處理后上皮性

4、卵巢癌細胞中PI3K/AKT及MAPK/ERK信號轉導通路活性的變化，細胞周期蛋白凋亡相關蛋白表達變化。
　　結果:
　　1.不同濃度的TOFA(1、5、10、20、50μg/ml)分別作用24、48、72小時后，對COC1及COC1/DDP的增殖抑制作用呈時間和劑量依賴。COC1和COC1/DDP細胞的IC50分別為26.10μg/ml和11.59μg/ml。
　　2.低濃度TOFA（10μg/ml）作用24、48、

5、72小時后，能有效誘導COC1細胞發(fā)生G0/G1期阻滯，處于G0/G1期的細胞數(shù)分別為62.01％、55.84％和54.78％，對照組分別為29.92％、28.14％和34.55％，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。TOFA對COC1/DDP無明顯的細胞周期阻滯作用。
　　3.低濃度TOFA作用24、48、72小時后，能誘導細胞凋亡。10μg/mlTOFA作用COC1細胞后凋亡率為12.38％、42.59％、43.88％，和對照組

6、相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);5μg/mlTOFA作用COC1/DDP細胞48h、72h的凋亡率分別為32.16％、42.05％，和對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.TOFA作用COC1細胞后，抑制MAPK/ERK通路活化，在COC1和COC1/DDP細胞中能激活Caspase-3蛋白，抑制凋亡抑制基因Bcl-2的表達;下調細胞周期相關蛋白CyclinD1及CDK4表達。
　　結論:
　　T

7、OFA能有效抑制卵巢癌細胞及順鉑耐藥亞株增殖，呈時間和劑量依賴性;誘導細胞G0/G1期阻滯，和下調CyclinD1及CDK4蛋白表達相關;誘導細胞凋亡，激活Caspase-3凋亡通路，抑制Bcl-2蛋白表達;并下調ERK蛋白表達，TOFA發(fā)揮作用的機制可能與MAPK/ERK信號轉導通路相關。
　　第三部分:TOFA增強卵巢癌細胞化療敏感性的實驗研究
　　目的:
　　探討TOFA與紫杉醇(TAX)和順鉑(DDP)聯(lián)合應用

8、后對上皮性卵巢癌細胞及順鉑耐藥亞株的增殖抑制效應、細胞周期及凋亡情況的影響。
　　方法:
　　應用細胞增殖活性檢測試劑盒(CCK-8)檢測不同濃度TOFA聯(lián)合TAX和DDP對上皮性卵巢癌細胞及順鉑耐藥亞株增殖抑制效應，流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡變化。
　　結果:
　　1.TOFA和TAX聯(lián)合應用后能有效抑制COC1細胞增殖，低濃度TOFA(5μg/ml)+TAX(25nM)組和TOFA(10μg/ml)+TAX

9、(50nM)組作用48h及72h呈協(xié)同作用。TOFA(1μg/ml)+DDP(1μM)組和TOFA(5μg/ml)+DDP(5μM)聯(lián)合48h及72h同樣呈協(xié)同作用，與單一用藥組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。TOFA和TAX、DDP聯(lián)合后抑制COC1/DDP細胞增殖，并呈協(xié)同作用。
　　2.TOFA和TAX聯(lián)合應用誘導COC1細胞G0/G1期阻滯，但對COC1/DDP細胞則誘導G2/M期阻滯;TOFA+DDP誘導COC1細

10、胞和COC1/DDP細胞發(fā)生G2/M期阻滯。
　　3.TOFA+TAX組和TOFA+DDP組均可誘導COC1細胞和COC1/DDP細胞凋亡，并呈協(xié)同作用。
　　4.細胞經(jīng)TOFA處理后，COC1對DDP和TAX的敏感性明顯提高，對DDP和TAX的耐藥倍數(shù)分別為0.36和0.21;TOFA處理的COC1/DDP細胞對TAX的敏感性明顯提高，耐藥倍數(shù)為0.44。但對DDP的敏感性降低，出現(xiàn)部分耐藥，耐藥倍數(shù)為1.31。
　

11、　結論:
　　TOFA+TAX組和TOFA+DDP組可有效抑制上皮性卵巢癌細胞COC1和順鉑耐藥亞株COC1/DDP細胞增殖，并誘導不同細胞周期阻滯及細胞凋亡，呈協(xié)同作用。低劑量的TOFA和TAX及DDP聯(lián)合后能更有效地抑制細胞增殖，誘導凋亡，為探討新的化療方案提供實驗依據(jù)。
　　第四部分:TOFA對卵巢癌荷瘤小鼠的治療作用
　　目的:
　　應用動物模型研究TOFA對卵巢癌荷瘤小鼠的治療作用。
　　方法:<

12、br>　　選取鼠齡4-5周，雌性、體重17-20gBALB/c裸小鼠，分別收集COC1和COC1/DDP細胞2×106個，100μlRPMI-1640培養(yǎng)基重懸，接種于裸小鼠雙側大腿外側皮下。荷瘤裸鼠隨機分為5組，每組5只:(1)對照組;(2)DMSO組（腹腔注射）;(3)TOFA處理組(50mg/kg);(4)DDP處理組（5mg/kg）;(5)TOFA和DDP聯(lián)合處理組。每3天給一次藥，腹腔注射，連續(xù)治療2周。給藥過程中檢測裸鼠腫瘤

13、體積，給藥4周后處死。腫瘤體積計算公式為，體積=A×B2×0.5236（A:長，B:寬，單位為毫米）。
　　結果:
　　1.單純應用TOFA治療組和對照組相比無明顯治療效果，將TOFA和傳統(tǒng)化療藥物DDP聯(lián)合應用治療COC1荷瘤小鼠后，和對照組相比，腫瘤體積明顯減小(P＜0.05)，是對照組的48.3％（治療后第27天）。
　　2.應用TOFA治療COC1/DDP荷瘤小鼠后，和對照組相比，腫瘤體積明顯減小(P＜0.05