miR-99a靶向調(diào)控FGFR3抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究.pdf

1、根據(jù)2014年癌癥統(tǒng)計(jì)，卵巢癌是美國(guó)女性第五位致死的病因，全年發(fā)病人數(shù)21980，但死亡人數(shù)卻在14270。由于缺乏特異性的腹盆腔癥狀和敏感標(biāo)記物使得卵巢癌的早期診斷非常困難，當(dāng)最終確診時(shí)絕大多數(shù)患者都已經(jīng)進(jìn)展為晚期。因此，卵巢癌的死亡率居高不下，預(yù)后極差，5年預(yù)期總生存率往往不到30％。為了早期診斷及改善卵巢癌的預(yù)后，非常迫切需要尋找能夠輔助早期診斷卵巢癌，并有助于選擇最佳的、個(gè)性化的治療方案的腫瘤預(yù)測(cè)標(biāo)記物。
　　MicroR

2、NAs(miRNAs)是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，它是一組短鏈、非編碼的單鏈RNAs，直接作用于靶向mRNA的非翻譯區(qū)(Untranslated Regions，UTR)的堿基修復(fù)，成為了新的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)器。研究表明，miRNAs參與許多生理過(guò)程，譬如細(xì)胞循環(huán)、代謝作用、血管發(fā)生、分化、細(xì)胞調(diào)亡等。并且miRNAs的異常表達(dá)可能與腫瘤有關(guān)，其通過(guò)調(diào)節(jié)基因和信號(hào)途徑參與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和耐藥。最為可喜的是，已有證據(jù)表明miRNA在細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生

3、，不僅可以影響細(xì)胞的功能，也可以釋放入血液，來(lái)發(fā)揮調(diào)節(jié)遠(yuǎn)處靶基因的功能。與其他循環(huán)中的核酸相比，循環(huán)中的miRNA水平更加穩(wěn)定、具有可重復(fù)性和持續(xù)性。循環(huán)中的miRNA在多種實(shí)體瘤中被成功評(píng)估，可作為新的無(wú)創(chuàng)性的疾病早期診斷標(biāo)記物。
　　在上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer，EOC)中，miR-15a，miR-16，miR-31，miR-200家族等miRNAs表達(dá)上調(diào)，而let-7， miRNA-3

4、4 a/b/c，miRNA-100、miR-199a/214、miR-99a等miRNAs表達(dá)下調(diào)。其中的miR-99a位于與多種疾病有關(guān)的21q21上，研究表明miR-99a在肝細(xì)胞癌、前列腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌以及膀胱癌中均表達(dá)異常。已有研究通過(guò)miRNA微芯片技術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-99a在正常卵巢組織和卵巢癌中表達(dá)存在差異。然而，上皮性卵巢癌中miR-99a是否在血清中異常表達(dá)及其在卵巢癌中的生物學(xué)功能仍不清楚。因此，有必要驗(yàn)證m

5、iR-99a在卵巢癌，特別是上皮性卵巢癌中的作用。在本研究中，我們嘗試檢測(cè)miR-99a在上皮性卵巢癌臨床標(biāo)本和細(xì)胞系中的表達(dá)，此外，通過(guò)體外研究纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3（Fibroblast growth factor receptor3，F(xiàn)GFR3），來(lái)推測(cè)miR-99a在上皮性卵巢癌中的調(diào)控機(jī)制。
　　第一部分:miR-99a在上皮性卵巢癌患者血清及其卵巢癌組織中的表達(dá)
　　目的:檢測(cè)miR-99a在上皮性卵巢癌患者血清

6、、卵巢癌組織及卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)，探討miR-99a作為上皮性卵巢癌血清標(biāo)記物的可能性。
　　方法:1.留取15例卵巢癌患者及3例正常志愿者血液樣本，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清中miR-99a的表達(dá)。2.留取手術(shù)切除的組織標(biāo)本，同樣的方法檢測(cè)miR-99a在卵巢癌組織中的表達(dá)情況。3.同法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和正常卵巢組織細(xì)胞株OSE中miR-99a的表達(dá)。
　　結(jié)果:1.卵巢癌患者的血清中miR-99a的表達(dá)水平

7、下調(diào)。2.卵巢癌患者的卵巢癌組織中miR-99a的表達(dá)水平下調(diào)。3.卵巢癌細(xì)胞系中miR-99a表達(dá)水平下調(diào)。
　　結(jié)論:1.miR-99a在EOC中的表達(dá)下調(diào)，提示miR-99a可能是卵巢癌的一種抑癌基因。2.在卵巢癌患者血清中miR-99a表達(dá)下調(diào)，有望成為早期診斷上皮性卵巢癌的新的生物學(xué)標(biāo)記物。
　　第二部分:miR-99a靶點(diǎn)基因FGFR3的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證
　　目的:通過(guò)生物學(xué)信息法預(yù)測(cè)miR-99a調(diào)控的靶基因，

8、在卵巢癌細(xì)胞中進(jìn)一步驗(yàn)證miR-99a如何作用于靶基因，從而為進(jìn)一步闡明卵巢癌發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　方法:1.使用miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)軟件數(shù)據(jù)庫(kù)(PicTar、TargetScan、miRanda)尋找初步預(yù)測(cè)的靶基因，并將初測(cè)的基因進(jìn)行RNA雜交(http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)。2.采用RT-PCR和Westem Blot法檢測(cè)了OSE細(xì)胞和SKOV3

9、細(xì)胞中FGFR3的mRNA和蛋白表達(dá)水平，從而來(lái)驗(yàn)證FGFR3基因是否與EOC相關(guān)。3.構(gòu)建FGFR3的3'-UTR區(qū)的熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒pGL3-FGFR3，與miR-99a共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，相對(duì)于無(wú)處理組(No-treated)和突變組(pGL3-mut)，來(lái)觀察miR-99a對(duì)pGL3-FGFR3的熒光素酶活性的影響，進(jìn)而判斷miR-99a是否可直接調(diào)控FGFR3的3'-UTR區(qū)。4.為了研究miR-99a對(duì)FGFR3的表達(dá)水平的影響，

10、我們?cè)赟KOV3細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-99a，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)miR-99a轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-99a的表達(dá)水平升高。然后，我們通過(guò)RT-PCR、qRT-PCR及Western Blot檢測(cè)miR-99a過(guò)表達(dá)對(duì)FGFR3的mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響。進(jìn)一步驗(yàn)證兩者的關(guān)系。
　　結(jié)果:1.通過(guò)生物學(xué)信息法分析預(yù)測(cè)FGFR3是miR-99a的靶基因。2.FGFR3在SKOV3細(xì)胞中相比OSE細(xì)胞的表達(dá)水平顯著升高。3.miR

11、-99a調(diào)控FGFR3的3'-UTR區(qū)。4.miR-99a下調(diào)FGFR3的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)論:1.FGFR3是miR-99a的靶基因。2.miR-99a可下調(diào)卵巢癌細(xì)胞中FGFR3的表達(dá)。這可能是卵巢癌發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制之一。
　　第三部分:miR-99a調(diào)控靶基因FGFR3對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖水平的影響
　　目的:探討miR-99a對(duì)卵巢癌細(xì)胞的影響;敲減FGFR3對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖的影響。

12、r>　　方法:1.采用CCK-8法檢測(cè)miR-99a過(guò)表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響。2.采用siRNA技術(shù)是將卵巢癌細(xì)胞中的FGFR3的表達(dá)降低。3.采用CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA靶向敲減FGFR3后對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果:1.miR-99a過(guò)表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞增殖。2.siRNA有效靶向敲減FGFR3表達(dá)后，卵巢癌細(xì)胞增殖被顯著抑制。
　　結(jié)論:miR-99a通過(guò)靶向調(diào)節(jié)FGFR3抑制卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞