siRNA下調(diào)LSD1基因影響卵巢癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:
　　腫瘤的發(fā)病率和死亡率逐年上升成為危害人類健康的重大挑戰(zhàn)之一[1]。卵巢癌死亡率居?jì)D科惡性腫瘤首位[2]，近年來(lái)其發(fā)病率有上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅婦女生命健康。雖然在腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)的基礎(chǔ)上輔助化療能有效地改善卵巢癌患者的生存時(shí)間，但晚期患者五年生存率仍徘徊在30％左右。因此，尋找新型卵巢癌治療靶點(diǎn)，已成為現(xiàn)實(shí)的迫切需要。
　　腫瘤細(xì)胞增殖是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要特征之一[3]。組蛋白甲基化是一種重要的可逆性的表觀遺傳修飾

2、方式，參與調(diào)控染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和基因的表達(dá)，其甲基化狀態(tài)由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（histone methyltransferases，HMTs）和組蛋白去甲基化酶(histone demethylases，HDMs)共同調(diào)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基化與去甲基化失平衡與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1(Lysine specific demethylase1，LSD1)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的組蛋白去甲基化酶[5]，調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)

3、錄，在多種腫瘤組織中高表達(dá)，與腫瘤預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[6]，抑制LSD1能抑制腫瘤細(xì)胞增殖[7]，表明LSD1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用。由于表觀遺傳修飾可以導(dǎo)致基因沉默但不伴有基因序列的改變，因此，研究人類疾病表觀修飾機(jī)制對(duì)疾病的治療具有重要意義。目前有多種組蛋白修飾酶已成為腫瘤治療的重要靶點(diǎn)[8]，LSD1有望成為一種新的抗腫瘤作用的靶標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究LSD1對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響及可能機(jī)制，為尋求卵巢癌

4、治療的新靶標(biāo)提供理論基礎(chǔ)。
　　研究目的:
　　利用RNA干擾技術(shù)沉默卵巢癌細(xì)胞中的LSD1基因，探討其對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響及可能機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.LSD1在卵巢癌細(xì)胞株中的表達(dá)
　　應(yīng)用免疫印跡法(Western blot)在蛋白水平上檢測(cè)4種人卵巢癌細(xì)胞株ES-2、HO-8910、SKOV-3和OVCAR-3細(xì)胞中LSD1的表達(dá)情況。
　　2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　采用脂質(zhì)

5、體介導(dǎo)法將 LSD1-siRNA轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞株，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（FQ-PCR）和Western blot分別從 mRNA和蛋白水平檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后LSD1的表達(dá)。
　　3.沉默LSD1基因?qū)β殉舶┘?xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響
　　MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，EdU試劑盒檢測(cè)細(xì)胞DNA合成能力，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期。
　　4.沉默LSD1基因后細(xì)胞中H3K4me2水平的變化
　　通過(guò)Western blot檢測(cè)沉默

6、LSD1基因后細(xì)胞中H3K4me2的水平。
　　5. LSD1影響卵巢癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的機(jī)制研究
　　采用FQ-PCR檢測(cè)LSD1沉默后p21、CCNA2的mRNA的表達(dá)情況，初步探討LSD1基因?qū)β殉舶┘?xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)控的機(jī)制。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以-χ±s表示，行方差齊性檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

7、　　結(jié)果:
　　1. LSD1在多種卵巢癌細(xì)胞中均有表達(dá)，細(xì)胞株OVCAR-3的LSD1表達(dá)水平最高。
　　2. LSD1-siRNA轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞后，F(xiàn)Q-PCR和Western blot檢測(cè)顯示，LSD1的表達(dá)明顯受抑制，其 mRNA和蛋白表達(dá)抑制率分別為78.98%和48.72%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3. LSD1-siRNA轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞后，細(xì)胞增殖速度減慢，DNA合成能力降低，S期細(xì)胞比例

8、降低，G2/M期細(xì)胞比例增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　4. LSD1-siRNA轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞后，Western blot結(jié)果顯示，細(xì)胞中H3K4me2的水平升高，是空白對(duì)照組的1.57倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　5. LSD1-siRNA轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞后，F(xiàn)Q-PCR結(jié)果顯示，p21 mRNA表達(dá)升高，是空白對(duì)照組的1.36倍；CCNA2 mRNA表達(dá)水平較空白對(duì)照組下降了68.73%，差異