高效靶向調(diào)控Fas基因表達治療人卵巢癌的實驗研究.pdf

1、Fas基因是調(diào)控細胞凋亡最重要的基因，F(xiàn)as/Fas配體(FasL)通路異常不但與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，而且可能與腫瘤細胞對部分化療藥物的敏感性有關(guān)。部分卵巢癌細胞中Fas基因表達水平低下或缺失，一方面使腫瘤細胞對Fas基因介導(dǎo)凋亡的敏感性下降，另一方面也可能導(dǎo)致卵巢癌細胞對化療藥物產(chǎn)生抵抗。提高腫瘤細胞中Fas基因表達水平可能是卵巢癌基因治療的一種有效方法，但外源基因不能在靶部位獲得高效表達是目前腫瘤基因治療面臨的突出問題，本研究著重探討

2、如何實現(xiàn)Fas基因在腫瘤部位獲得高效特異性表達及Fas基因表達后引起的生物學(xué)效應(yīng)。 在研究的第一部分，采用免疫熒光流式細胞術(shù)檢測多種卵巢癌細胞系中Fas基因的表達，并測定攜帶增強型綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因的腺病毒載體Ad5-EGFP和嵌合型腺病毒載體Ad5F35-EGFP對不同卵巢癌細胞系的轉(zhuǎn)染率。結(jié)果表明，卵巢癌細胞中Fas基因表達具有異質(zhì)性，其中泰素敏感型和耐藥型SKOV3細胞系Fas表達水平最低；Ad5和Ad5F3

3、5對不同卵巢癌細胞系的轉(zhuǎn)染效率差異較大，但就對同一種卵巢癌細胞系的轉(zhuǎn)染能力而言，Ad5略優(yōu)于Ad5F35。 第二部分應(yīng)用基因重組技術(shù)克隆構(gòu)建了3個含腫瘤特異性啟動子hTERT及二步轉(zhuǎn)錄放大系統(tǒng)(TSTA)調(diào)控元件的穿梭質(zhì)粒，分別命名為pDC316-hTERT-Fas、pDC316-hTERT-GAL4VP2、pDC316-G5E4T-Fas，采用AdMaxTM系統(tǒng)將其包裝成重組腺病毒載體Ad5-hTERT-Fas、Ad5-hTE

4、RT-GAL4VP2和Ad5-G5E4T-Fas，并進行純化擴增。 第三部分采用制備好的重組腺病毒分別轉(zhuǎn)染泰素敏感型/耐藥型SKOV3細胞系及人胚肺成纖維細胞(HELF)，并測定Fas基因表達水平；然后分別聯(lián)合應(yīng)用抗FasIgM抗體或γδT淋巴細胞，觀察癌細胞的生長抑制作用及化療敏感性有無改變。結(jié)果證實，攜帶hTERT和TSTA調(diào)控元件的Ad5轉(zhuǎn)染靶細胞后，能使靶基因在卵巢癌細胞中特異性表達，熒光定量PCR表明Ad5轉(zhuǎn)染的SKO

5、V3細胞中Fas基因表達量提高14倍。抗FasIgM抗體能使轉(zhuǎn)導(dǎo)Fas的SKOV3凋亡率明顯提高，γδT細胞對其殺傷率亦明顯增強。但Fas基因轉(zhuǎn)導(dǎo)前后，耐藥型SKOV3細胞系對泰素的敏感性無明顯改變。 第四部分建立人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型，通過比較向瘤體內(nèi)注射不同藥物后腫瘤的生長狀況，以評價攜帶Fas基因的腺病毒聯(lián)合γδT細胞治療人卵巢癌皮下移植瘤的可行性。結(jié)果顯示，攜帶EGFP報告基因或Fas基因的腺病毒瘤體直接注射后，外源

6、基因在靶部位出現(xiàn)較強表達，Ad5-hTERT-TSTA-Fas聯(lián)合γδT細胞治療皮下移植瘤有相當(dāng)?shù)男Ч?，重量抑瘤率達50.9％。 結(jié)論：就卵巢癌細胞和非永生化細胞而言，hTERT啟動子能調(diào)控外源基因在卵巢癌細胞中特異性表達，TSTA系統(tǒng)能明顯增強弱啟動子hTERT的活性，使靶基因在卵巢癌細胞中高效特異性表達?？笷asIgM抗體或γδT細胞能對轉(zhuǎn)導(dǎo)Fas基因的SKOV3細胞誘導(dǎo)凋亡及造成明顯生長抑制；攜帶Fas基因的腺病毒聯(lián)合γδ