人卵巢癌類干細(xì)胞生長特性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的: 卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤，其死亡率居?jì)D科惡性腫瘤首位，目前已成為嚴(yán)重威脅婦女生命和健康的主要腫瘤，其主要特征是腫瘤細(xì)胞的惡性生長、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及化療耐藥，病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，最近研究認(rèn)為，腫瘤中存在一小群具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞，即腫瘤干細(xì)胞，這種細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，例如非錨著性生長，自我更新和無限增殖，多向分化潛能和天然耐藥性，對化療藥物易產(chǎn)生抵抗作用，它們可能是腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源。目前為止，研究人員

2、已經(jīng)在白血病、乳腺癌以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中分離并鑒定出了腫瘤干細(xì)胞，另外，在肺癌、前列腺癌和卵巢癌中也發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細(xì)胞，由于干細(xì)胞在體外很難分離純化，長期傳代，所以為臨床治療帶來困難，我們的前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)從卵巢癌細(xì)胞系中成功分離出卵巢癌類干細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上，我們探討卵巢癌類干細(xì)胞凍存復(fù)蘇的條件及保存?zhèn)鞔姆椒?，通過計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)的方法繪制細(xì)胞生長曲線、計(jì)算分裂指數(shù)，了解卵巢癌類干細(xì)胞的生長特性，為進(jìn)一步從腫瘤干細(xì)胞方面研究腫瘤的耐藥機(jī)制提供可

3、信的理論依據(jù)，從而為臨床上卵巢癌的治療提供更多的可行性。 材料與方法: 一、材料 1、細(xì)胞系 卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科周欣老師惠贈。 2、主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen)、B27添加劑(Gibco)、EGF(Peprotech)、bFGF(Peprotech)、肝素(Sigma)、胰蛋白酶(Sigma)、胰酶抑制劑(Gibco)、超

4、低吸附的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Coming)、甘油(Glycerol Biosharp Amresco)、Giemsa染液(沈陽試劑三廠)、FBS(天津顥洋生物制品科技有限責(zé)任公司) 3、主要儀器 CO2孵箱(RS biotech galaxyS)、超凈工作臺(ESCO biotech sve—4A1)、倒置相差顯微鏡(OLYPUS) 二、方法 采用無血清懸浮培養(yǎng)的方法提取卵巢癌類干細(xì)胞并進(jìn)行凍存和復(fù)蘇，細(xì)胞

5、計(jì)數(shù)法繪制生長曲線、計(jì)算分裂指數(shù)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1、細(xì)胞培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察 將貼壁細(xì)胞消化后，通過無血清培養(yǎng)可獲得具有非錨著性懸浮生長的細(xì)胞球，其在超低吸附培養(yǎng)板中和瓊脂鋪板的培養(yǎng)皿中細(xì)胞球形態(tài)基本相同(前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)初步證實(shí)我們獲得的細(xì)胞球富集卵巢癌類干細(xì)胞，具有自我更新、無限增值的能力)。 2、卵巢癌類干細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 從貼壁細(xì)胞中提取出卵巢癌類干細(xì)胞后可以連續(xù)傳代達(dá)14代以上。 3

6、、細(xì)胞凍存復(fù)蘇實(shí)驗(yàn) 用兩種凍存液凍存的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后生長狀態(tài)均良好，傳代一次后計(jì)算增殖情況無明顯差別。 4、生長曲線 細(xì)胞在最初3天內(nèi)生長速度較緩慢，曲線基本成平線狀，第4天開始出現(xiàn)對數(shù)期生長；懸浮細(xì)胞的生長速度較貼壁細(xì)胞緩慢。 5、分裂指數(shù) 貼壁細(xì)胞在72小時(shí)前分裂指數(shù)呈上升趨勢，72小時(shí)達(dá)到峰值，而后分裂指數(shù)逐漸下降。 結(jié)論: 1、將貼壁細(xì)胞消化后，通過無血清培養(yǎng)可獲得具有非錨著