細(xì)胞周期蛋白CDC50A參與維持卵巢癌干細(xì)胞特性及其相關(guān)作用機(jī)制的研究.pdf

1、卵巢癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)生率僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，居第三位，然而其致死率高居首位。卵巢癌起病隱匿，大多數(shù)患者診斷時(shí)已為晚期。在過(guò)去的幾十年中，對(duì)卵巢癌患者的基本治療方案采取理想的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)輔助鉑類藥物為主的聯(lián)合化療，雖然取得了一定的療效，但是仍有70％左右的患者在18個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)，晚期卵巢癌患者的5年生存率僅為30％。目前認(rèn)為腫瘤的耐藥及復(fù)發(fā)是造成卵巢癌高死亡率的主要原因，但是卵巢癌耐藥及復(fù)發(fā)的機(jī)制目前仍不清楚，故而嚴(yán)

2、重阻礙了卵巢癌的有效治療。
　　自上世紀(jì)來(lái)，腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cells，CSCs)理論被提出，認(rèn)為腫瘤組織中存在少量的干細(xì)胞，是導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展、復(fù)發(fā)及化療耐藥的根源。Bonnet和Dick從白血病患者中分離出CD34+CD38-細(xì)胞被證實(shí)具有干細(xì)胞特性，這是世界上首次發(fā)現(xiàn)CSCs的存在。之后大量研究相繼發(fā)現(xiàn)多種實(shí)體腫瘤中也存在極少量的CSCs，如乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等。研究表明，CSCs具有分化、自我更新等類

3、似正常干細(xì)胞的生物學(xué)特性，同時(shí)具有致瘤能力且對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。目前腫瘤干細(xì)胞的研究取得了很大的進(jìn)展，在一些實(shí)體腫瘤中已建立了一系列CSCs分離、鑒定的方法，對(duì)腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、耐藥和復(fù)發(fā)的機(jī)制的研究以及探索腫瘤治療的新領(lǐng)域具有重要意義。
　　近年來(lái)，CSCs理論被應(yīng)用于卵巢癌的研究中取得了一定的成績(jī)。但是，目前對(duì)于卵巢癌干細(xì)胞的研究仍在借鑒其他實(shí)體腫瘤的方法，如對(duì)卵巢癌干細(xì)胞的識(shí)別缺乏較為特異的標(biāo)記物，目前使用較多的標(biāo)記物有CD

4、133、CD117、CD44、ALDH1、EPCAM等，其中CD44被作為乳腺癌、胰腺癌等CSCs的標(biāo)記物，CD133被作為結(jié)腸癌等CSCs的標(biāo)記物等。其分離獲得的方法仍主要依靠SP細(xì)胞的分選。因此，尋找特異性的表面標(biāo)記物，對(duì)于卵巢癌干細(xì)胞的研究極其重要，對(duì)探索卵巢癌新的治療方法具有重大意義。
　　本課題前期工作中利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記及質(zhì)譜為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析比較卵巢癌細(xì)胞系SP和非SP細(xì)胞膜蛋白的差異表達(dá)，篩選出一種跨膜蛋白

5、30A（transmembrane protein30A，TMEM30A），又稱細(xì)胞周期蛋白50A(cell division cycle50A，CDC50A)，并通過(guò)大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對(duì)卵巢癌細(xì)胞系及原代卵巢癌細(xì)胞CDC50A+細(xì)胞進(jìn)行鑒定，證實(shí)其具有CSCs生物學(xué)特性，是CDC50A有望成為卵巢癌干細(xì)胞較為特異的表面標(biāo)記物。
　　目的：
　　本研究承接前期工作，對(duì)CDC50A參與維持卵巢癌干細(xì)胞特性及其相關(guān)作用機(jī)制做進(jìn)一步研

6、究。
　　方法：
　　1.構(gòu)建CDC50A+細(xì)胞比例下調(diào)的SKOV3細(xì)胞。用4段CDC50A shRNA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，運(yùn)用Western blot方法篩選能有效下調(diào)CDC50A基因表達(dá)的shRNA，包裝慢病毒載體，并利用通過(guò)慢病毒感染技術(shù)，下調(diào)卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中CDC50A+細(xì)胞比例，利用流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)其下調(diào)效率。利用流式分選儀分選得到CDC50A+細(xì)胞比例下調(diào)組(SKOV3 CDC50A-GFP)細(xì)胞和陰性對(duì)

7、照組(SKOV3NC-GFP)細(xì)胞。采用流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)SKOV3 CDC50A-GFP及SKOV3 NC-GFP中CDC50A的表達(dá)水平。
　　2.CDC50A+細(xì)胞比例下調(diào)的SKOV3細(xì)胞干細(xì)胞特性的鑒定。利用含血清的HG-DMEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)，驗(yàn)證SKOV3 CDC50A-GFP及SKOV3 NC-GFP細(xì)胞的分化能力。利用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)方法，檢測(cè)SKOV3 CDC50A-GFP及SKOV3 NC-GFP細(xì)胞sphere

8、形成能力及傳代能力，并運(yùn)用流式細(xì)胞學(xué)方法驗(yàn)證sphere對(duì)CDC50A的富集作用。MTT法檢測(cè)SKOV3 CDC50A-GFP和NC-GFP細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。將SKOV3 CDC50A-GFP和NC-GFP細(xì)胞等量接種于NSG小鼠皮下，觀察成瘤情況，檢測(cè)其成瘤能力。
　　3.人卵巢癌CDC50A+和CDC50A-細(xì)胞RNA測(cè)序及其與干細(xì)胞功能相關(guān)的機(jī)制分析。收集3例卵巢癌患者腫瘤組織，分離得到卵巢癌細(xì)胞，利用流式細(xì)胞分選儀分選獲

9、得CDC50A+和CDC50A-細(xì)胞，分別提取兩組細(xì)胞RNA，進(jìn)行RNA測(cè)序。獲得兩組細(xì)胞的差異表達(dá)基因，并對(duì)其進(jìn)行功能分析和相關(guān)信號(hào)通路的富集分析。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建CDC50A+細(xì)胞比例下調(diào)的SKOV3細(xì)胞。Western方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染4段CDC50A shRNA的293T細(xì)胞的CDC50A表達(dá)，序列TMEM30A-homo-974沉默CDC50A基因的效率最高，其靶序列為GCCTGTGAACTGGCTTAAA

10、CC。將其包裝慢病毒載體后，感染293T細(xì)胞，Western法檢測(cè)其能使CDC50A表達(dá)降低80％以上。利用慢病毒感染SKOV3細(xì)胞，流式檢測(cè)其感染效率CDC50A-GFP組為87.9％，NC-GFP組為81.6％。分選出成功感染慢病毒的兩組細(xì)胞后，流式分析SKOV3 NC-GFP細(xì)胞中CDC50A細(xì)胞比例為0.48％，而SKOV3 CDC50A-GFP細(xì)胞中CDC50A+細(xì)胞僅占0.12％。表明慢病毒感染能有效的下調(diào)卵巢癌細(xì)胞系SKO

11、V3中CDC50A+細(xì)胞比例，而含陰性對(duì)照序列的慢病毒感染對(duì)SKOV3細(xì)胞中CDC50A基因的表達(dá)基本無(wú)影響。
　　2.CDC50A+細(xì)胞比例下調(diào)的SKOV3細(xì)胞株干細(xì)胞的生物學(xué)特性減弱。在無(wú)血清懸浮培養(yǎng)條件下，NC-GFP細(xì)胞能形成sphere，且絕大多數(shù)能帶有綠色熒光;而CDC50A-GFP細(xì)胞sphere形成慢，且在熒光顯微鏡下僅能看到極少帶綠色熒光的sphere。SKOV3 CDC50A-GFP細(xì)胞形成的sphere個(gè)數(shù)明

12、顯少于SKOV3 NC-GFP細(xì)胞，幾乎不能傳代;而SKOV3 NC-GFP細(xì)胞形成的sphere能連續(xù)傳代至少三代。表明CDC50A基因被沉默的卵巢癌細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞在體外sphere形成能力減弱且喪失自我更新及分化能力。流式檢測(cè)SKOV3 CDC50A-GFP和NC-GFP細(xì)胞所形成的sphere中CDC50A+細(xì)胞的比例分別為19.7％和6.7％，均比貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞中的CDC50A+細(xì)胞的比例明顯升高，但SKOV3 CDC50

13、A-GFP細(xì)胞中CDC50A+比例明顯低于NC-GFP細(xì)胞。表明sphere對(duì)CDC50A+細(xì)胞具有富集作用。MTT法測(cè)定順鉑對(duì)SKOV3 CDC50A-GFP和NC-GFP細(xì)胞的IC50均值為1.33±0.14ug/ml，3.05±0.39 ug/ml，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01)。說(shuō)明CCDC50A+細(xì)胞比例下調(diào)的的卵巢癌細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性減弱。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示103 NC-GFP細(xì)胞能使小鼠成瘤，而同樣數(shù)量的CD

14、C50A-GFP細(xì)胞未能使小鼠成瘤。表明CDC50A基因被沉默的卵巢癌細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞致瘤能力降低。
　　3.通過(guò)對(duì)CDC50A+細(xì)胞與CDC50A-細(xì)胞的RNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了一些CDC50A參與維持卵巢癌干細(xì)胞特性的相關(guān)機(jī)制。對(duì)3原代卵巢癌組織中分選出的CDC50A+細(xì)胞和CDC50A-細(xì)胞進(jìn)行RNA測(cè)序，分別篩選出92、59和251個(gè)差異表達(dá)基因(P＜0.01)。應(yīng)用RNA譜分析、生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)差異基因及其轉(zhuǎn)錄本其進(jìn)行分析

15、分析發(fā)現(xiàn)CDC50A可能通過(guò)ATPase H+ transporting V1 subunit F、MALAT1、MAPK信號(hào)及調(diào)控核糖體、剪接體功能維持卵巢癌干細(xì)胞的特性及功能。
　　結(jié)論：
　　1.利用CDC50A shRNA慢病毒載體感染技術(shù)能有效的下調(diào)卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中CDC50A+細(xì)胞比例。
　　2.CDC50A+細(xì)胞比例下調(diào)的卵巢癌細(xì)胞系SKOV3干細(xì)胞生物學(xué)特性減弱，sphere形成能力、自我更新和