CREPT與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白c-myc、CDC25A在NSCLC中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡最主要的原因[1]。大約85％的肺癌病例診斷為非小細(xì)胞肺癌(Non-small-cell lung carcinoma，NSCLC)[2]。低于15%的5年生存率提示我們NSCLC預(yù)后很差。因此，亟需發(fā)現(xiàn)新的NSCLC治療方案。研究NSCLC的分子機(jī)制，闡明其相關(guān)致癌基因和腫瘤抑制劑在這個(gè)惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，這將有助于異常的信號(hào)通路和新的分子治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)[3]。在臨床研究中，準(zhǔn)確和可靠

2、的腫瘤標(biāo)志物有助于提供更全面的預(yù)后信息和更準(zhǔn)確的治療決策[4]。
　　CREPT(cell-cycle related and expression-elevated protein in tumor，Gene_ID58490, Genbank NM_021215),是近年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的候選癌基因，又稱RPRD1B(regulation of nuclear pre-mRNA domain containing protein1B

3、)和C20ORF77。研究表明，CREPT可以通過上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤發(fā)生。CREPT在多種腫瘤組織中都有高表達(dá)，且與腫瘤分期、組織學(xué)分型和預(yù)后密切相關(guān)[5-7]。CREPT可以與RNA聚合酶II（RNAP II）形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，作用于細(xì)胞周期蛋白cyclin D1的啟動(dòng)子上，從而增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞增殖相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤[8]。
　　鑒于以上研究基礎(chǔ)，我們推測CREPT可能會(huì)加快NSCL

4、C細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)其增殖，進(jìn)而加快NSCLC的發(fā)展，或可成為一個(gè)新的常見的腫瘤細(xì)胞特異標(biāo)記物。然而，CREPT分子的調(diào)控機(jī)制及其是否促進(jìn)了NSCLC的發(fā)展仍不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)將著重探討CREPT在NSCLC中的表達(dá)及其與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的相互作用，為進(jìn)一步研究其分子在NSCLC發(fā)展中的機(jī)制，提出一個(gè)新的臨床治療目標(biāo)提供基礎(chǔ)。
　　目的：
　　探討CREPT在NSCLC組織和細(xì)胞系中mRNA和蛋白的表達(dá)情況。運(yùn)用CREPT

5、-Si-RNA干擾慢病毒，構(gòu)建CREPT低表達(dá)的肺癌細(xì)胞系。檢測CREPT正常表達(dá)及其干涉后對(duì)肺鱗癌Calu-1細(xì)胞系和肺腺癌H838細(xì)胞系細(xì)胞生長、增殖、周期分布、凋亡比例、遷移和侵襲能力的作用影響，闡明CREPT在NSCLC中發(fā)揮的作用。檢測CREPT高低表達(dá)肺癌細(xì)胞系中的細(xì)胞周期相關(guān)因子c-myc和CDC25A的mRNA和蛋白表達(dá)水平變化情況，揭示CREPT可能的分子調(diào)控機(jī)制。檢測CREPT和c-myc蛋白在NSCLC鱗、腺癌組織

6、和肺鱗癌 Calu-1細(xì)胞、肺腺癌 H838細(xì)胞中是否存在共定位現(xiàn)象。評(píng)價(jià)CREPT與c-myc、CDC25A蛋白表達(dá)是否存在相關(guān)性。
　　方法：
　　1.real-time RT-PCR和Western Blot檢測CREPT在NSCLC組織和肺鱗癌Calu-1、H520細(xì)胞系和肺腺癌A549、H838、SK-LU-1、SPC-A-1細(xì)胞系以及正常的人類支氣管上皮HBE細(xì)胞系中mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　2.運(yùn)用C

7、REPT-Si-RNA干擾慢病毒干涉肺鱗癌Calu-1細(xì)胞系和肺腺癌H838細(xì)胞系中CREPT的表達(dá)，構(gòu)建CREPT低表達(dá)的肺癌細(xì)胞系。運(yùn)用real-time RT-PCR和Western Blot檢測感染細(xì)胞系中CREPT的mRNA和蛋白表達(dá)水平，驗(yàn)證Si-RNA干擾慢病毒對(duì)目的基因的抑制效率是否達(dá)到80%以上。
　　3.MTT法檢測慢病毒干涉CREPT表達(dá)前后細(xì)胞的生長曲線，觀察病毒感染細(xì)胞生長能力的變化。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測

8、干涉前后細(xì)胞的克隆形成數(shù)，觀察病毒感染細(xì)胞增值能力的變化。流式細(xì)胞技術(shù)檢測干涉前后細(xì)胞的周期分布情況和細(xì)胞凋亡比例。
　　4.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測慢病毒干涉CREPT表達(dá)前后細(xì)胞的劃痕愈合率；細(xì)胞Transwell試驗(yàn)檢測干涉前后的穿膜細(xì)胞數(shù)，觀察病毒感染細(xì)胞遷移能力的變化。細(xì)胞Matrigel試驗(yàn)檢測干涉前后的穿膜細(xì)胞數(shù)，觀察病毒感染細(xì)胞侵襲能力的變化。
　　5.real-time RT-PCR和WesternBlot檢測測慢

9、病毒干涉CREPT表達(dá)前后細(xì)胞中的細(xì)胞周期相關(guān)因子c-myc和CDC25A的mRNA和蛋白表達(dá)水平。免疫激光共聚焦檢測CREPT和c-myc蛋白在NSCLC組織和肺鱗癌Calu-1、肺腺癌H838細(xì)胞中是否存在共定位現(xiàn)象。對(duì)NSCLC組織采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測CREPT和c-myc、CDC25A蛋白表達(dá)情況并進(jìn)行等級(jí)評(píng)分，評(píng)價(jià)CREPT與c-myc、CDC25A蛋白表達(dá)是否存在相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1.real-t

10、ime RT-PCR和Western Blot結(jié)果證實(shí)：CREPT的mRNA和蛋白表達(dá)水平在NSCLC組織中明顯高于與其相鄰的正常肺組織。在肺鱗癌Calu-1、H520細(xì)胞系和肺腺癌A549、H838、SK-LU-1、SPC-A-1細(xì)胞系中，CREPT的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于正常人類支氣管上皮HBE細(xì)胞。在肺鱗癌細(xì)胞系中Calu-1細(xì)胞CREPT的表達(dá)水平高于H520細(xì)胞，故選擇Calu-1細(xì)胞系進(jìn)行下一步干擾慢病毒感染。在肺腺

11、癌細(xì)胞系中，SK-LU-1細(xì)胞CREPT的表達(dá)水平高于其他細(xì)胞，但預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SK-LU-1細(xì)胞系不能耐受病毒感染，故選擇CREPT表達(dá)水平次高的H838細(xì)胞系進(jìn)行下一步干擾慢病毒感染。
　　2.real-time RT-PCR和Western Blot檢測證實(shí)Si-RNA干擾慢病毒對(duì)目的基因的抑制效率均達(dá)到80%以上，表明成功構(gòu)建CREPT低表達(dá)的肺鱗癌Calu-1-siRNA細(xì)胞系和肺腺癌H838-siRNA細(xì)胞系，為進(jìn)一

12、步研究CREPT的作用機(jī)制及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路搭建了平臺(tái)。
　　3.MTT法測定細(xì)胞生長曲線顯示：從第3天起細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長期，CREPT干涉組細(xì)胞的生長曲線較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞的明顯低且緩。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示：CREPT干涉組Calu-1-siRNA細(xì)胞的克隆形成數(shù)較陰性對(duì)照組Calu-1-NC細(xì)胞和空白對(duì)照組Calu-1細(xì)胞減少(CREPT-siRNA83±11vs.NC294±27、Control312±31)，差異性顯

13、著(P＜0.05)。同樣，CREPT干涉組H838-siRNA細(xì)胞的克隆形成數(shù)較陰性對(duì)照組H838-NC細(xì)胞和空白對(duì)照組H838細(xì)胞減少(CREPT-siRNA68±8vs.NC243±24、Control255±29)，差異性顯著(P＜0.05)。
　　流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期分布結(jié)果顯示：CREPT干涉組Calu-1-siRNA細(xì)胞中處于G1期的細(xì)胞比例較陰性對(duì)照組Calu-1-NC細(xì)胞和空白對(duì)照組 Calu-1細(xì)胞增多（CR

14、EPT-siRNA69.06±2.96%vs.NC51.95±6.85%、Control48.96±4.89%），差異性顯著(P＜0.05)。CREPT干涉組 Calu-1-siRNA細(xì)胞中處于 S期的細(xì)胞比例較陰性對(duì)照組Calu-1-NC細(xì)胞和空白對(duì)照組Calu-1細(xì)胞降低（CREPT-siRNA16.24±2.12%vs. NC25.29±4.29%、Control34.36±8.40%），差異性顯著(P＜0.05)。根據(jù)細(xì)胞增殖指

15、數(shù)公式(PI)=(S+G2)%，計(jì)算得出各組細(xì)胞增殖指數(shù)PI值分別為(CREPT-siRNA30.94±3.61 vs. NC48.41±4.51、Control51.05±3.20)。統(tǒng)計(jì)分析得出CREPT干涉組細(xì)胞PI值同陰性對(duì)照組細(xì)胞和空白對(duì)照組細(xì)胞間有明顯差異(P＜0.05)。
　　同樣，CREPT干涉組 H838-siRNA細(xì)胞中處于 G1期的細(xì)胞比例較陰性對(duì)照組H838-NC細(xì)胞和空白對(duì)照組H838細(xì)胞增多（CREPT

16、-siRNA68.47±3.60%vs. NC52.23±3.16%、Control52.99±14.98%），差異性顯著(P＜0.05)。CREPT干涉組H838-siRNA細(xì)胞中處于 S期的細(xì)胞比例較陰性對(duì)照組H838-NC細(xì)胞和空白對(duì)照組 H838細(xì)胞增多（CREPT-siRNA17.71±1.08% vs.NC25.32±2.32%、Control27.42±6.15%），差異性顯著(P＜0.05)。根據(jù)細(xì)胞增殖指數(shù)公式(PI)

17、=(S+G2)%，計(jì)算得出各組細(xì)胞增殖指數(shù)PI值分別為(CREPT-siRNA31.53±4.64vs.NC47.77±3,58、Control44.31±5.38)。統(tǒng)計(jì)分析得出CREPT干涉組細(xì)胞 PI值同陰性對(duì)照組細(xì)胞和空白對(duì)照組細(xì)胞間有明顯差異(P＜0.05)。
　　流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡比例結(jié)果顯示：CREPT干涉組Calu-1-siRNA細(xì)胞中處于 B2、B4期的細(xì)胞較陰性對(duì)照組 Calu-1-NC細(xì)胞和空白對(duì)照組

18、Calu-1細(xì)胞增多（CREPT-siRNA10.20±2.80%vs. NC2.57±0.44%、Control2.78±0.68%），差異性顯著(P＜0.01)。同樣，CREPT干涉組H838-siRNA細(xì)胞中處于B2、B4期的細(xì)胞較陰性對(duì)照組H838-NC細(xì)胞和空白對(duì)照組H838細(xì)胞增多（CREPT-siRNA10.58±3.29%vs. NC2.77±0.54%、Control2.88±0.73%），差異性顯著(P＜0.01)。

19、
　　4.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：CREPT干涉組Calu-1-siRNA細(xì)胞的劃痕愈合率較陰性對(duì)照組Calu-1-NC細(xì)胞和空白對(duì)照組Calu-1細(xì)胞降低（CREPT-siRNA45±8%vs. NC83±11%、Control92±6%），差異性顯著(P＜0.05)。同樣，CREPT干涉組H838-siRNA細(xì)胞的劃痕愈合率較陰性對(duì)照組 H838-NC細(xì)胞和空白對(duì)照組 H838細(xì)胞降低（CREPT-siRNA39±12%vs.

20、NC78±4%、Control85±7%），差異性顯著(P＜0.05)。
　　細(xì)胞Transwell試驗(yàn)結(jié)果顯示：CREPT干涉組Calu-1-siRNA細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)較陰性對(duì)照組Calu-1-NC細(xì)胞和空白對(duì)照組Calu-1細(xì)胞降低(CREPT-siRNA74±16vs. NC283±35、Control295±26)，差異性顯著(P＜0.01)。同樣，CREPT干涉組H838-siRNA細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)較陰性對(duì)照組 H838

21、-NC細(xì)胞和空白對(duì)照組 H838細(xì)胞降低(CREPT-siRNA69±13 vs. NC271±29、Control307±32)，差異性顯著(P＜0.01)。
　　細(xì)胞Matrigel試驗(yàn)結(jié)果顯示：CREPT干涉組Calu-1-siRNA細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)較陰性對(duì)照組Calu-1-NC細(xì)胞和空白對(duì)照組Calu-1細(xì)胞降低(CREPT-siRNA40±11 vs. NC137±15、Control125±21)，差異性顯著(P＜0.

22、01)。同樣，CREPT干涉組H838-siRNA細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)較陰性對(duì)照組 H838-NC細(xì)胞和空白對(duì)照組 H838細(xì)胞降低(CREPT-siRNA36±7 vs. NC102±18、Control117±23)，差異性顯著(P＜0.01)。
　　5.real-time RT-PCR和Western Blot結(jié)果證實(shí)：在CREPT干涉組Calu-1-siRNA細(xì)胞和H838-siRNA細(xì)胞中，細(xì)胞周期相關(guān)因子c-myc和CDC

23、25A基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞（P＜0.05）。免疫激光共聚焦結(jié)果證實(shí)：CREPT和c-myc蛋白在NSCLC鱗、腺癌組織和肺鱗癌Calu-1細(xì)胞和肺腺癌H838細(xì)胞中均存在共定位現(xiàn)象。NSCLC組織經(jīng)免疫組織化學(xué)染色，對(duì)CREPT和c-myc、CDC25A蛋白表達(dá)情況進(jìn)行等級(jí)評(píng)分，結(jié)果顯示：在NSCLC組織中，CREPT和c-myc、CDC25A蛋白在鱗癌、腺癌中的表達(dá)存在相關(guān)性(P＜0.05,

24、rs＞0.434)。在分化程度(P＜0.05, rs＞0.378)和pTNM分期(P＜0.05, rs＞0.352)上同樣存在相關(guān)性。
　　結(jié)論：
　　1. CREPT在NSCLC組織和細(xì)胞系中均高表達(dá)，提示CREPT可能在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著作用。Calu-1和 H838細(xì)胞系CREPT表達(dá)更高，更適合進(jìn)行干擾慢病毒感染。
　　2.成功構(gòu)建CREPT低表達(dá)的NSCLC細(xì)胞系，為進(jìn)一步研究CREPT的作用機(jī)制及

25、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路搭建了平臺(tái)。
　　3.下調(diào) CREPT的表達(dá)可以降低 NSCLC細(xì)胞的生長增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制NSCLC細(xì)胞遷移侵襲的能力。表明CREPT具有促進(jìn)NSCLC發(fā)展的作用。
　　4. CREPT可以調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)因子c-myc和CDC25A的表達(dá)，CREPT與c-myc蛋白表達(dá)存在共定位現(xiàn)象，且CREPT、c-myc和CDC25A的蛋白表達(dá)存在相關(guān)性，提示在NSCLC中可能存在著一條新的CREPT/c-myc/