細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1與PACSIN2在影響細(xì)胞遷移中的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、腫瘤是一種細(xì)胞周期性疾病，腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞增殖失控、分化障礙及凋亡受阻密切相關(guān)，因此與細(xì)胞增殖有關(guān)的周期蛋白成為研究癌癥發(fā)生的熱點(diǎn)之一。細(xì)胞周期的變化是一個(gè)復(fù)雜的過程，許多蛋白參與調(diào)控該過程。其中D型周期蛋白作用于G1期，分為3個(gè)亞型：Cyclin D1、Cyclin D2、Cyclin D3。但只有Cyclin D1被檢測(cè)到在腫瘤中過度表達(dá)。Cyclin D1又存在Cyclin D1a和CyclinD1b兩種亞型，通常Cyclin D

2、1即指Cyclin D1a。
　　 正常的細(xì)胞周期有序的循環(huán)是通過激活和失活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)來實(shí)現(xiàn)的。CyclinD1作為細(xì)胞周期進(jìn)程的啟動(dòng)子，可以與CDK4結(jié)合形成復(fù)合體，通過磷酸化和失活視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白pRb，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期到S期的進(jìn)展，并通過這種方式介導(dǎo)DNA的合成、促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。而Cyclin D1在不依賴CDK的情況下同樣可以對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和新陳代謝發(fā)揮作用。
　　 研究表明，C

3、yclin D1在人類多種腫瘤如乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌以及造血系統(tǒng)惡性腫瘤中存在過度表達(dá)。在侵襲性乳腺腫瘤中，50％病例存在Cyclin D1蛋白的過度表達(dá)。為了探討Cyclin D1在腫瘤中的作用，我們做了大量研究。我們發(fā)現(xiàn)Cyclin D1缺失的小鼠會(huì)耐受致癌基因誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生；Cyclin D1基因的缺失也可以降低細(xì)胞存活和DNA合成，增加線粒體的大小和活性，抑制血管、骨髓巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞的遷移能力。臨床病例也

4、顯示CyclinD1過度表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移存在聯(lián)系。因此，疾病的惡性進(jìn)展和轉(zhuǎn)移可能與CyclinD1密切相關(guān)。
　　 細(xì)胞的遷移在細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、組織修復(fù)和腫瘤轉(zhuǎn)移中是必不可少的。腫瘤轉(zhuǎn)移是從腫瘤原發(fā)病灶的腫瘤細(xì)胞的遷移開始的，經(jīng)過進(jìn)入血管的內(nèi)滲和穿過血管壁的溢出過程，最后到達(dá)遠(yuǎn)處器官或組織從而產(chǎn)生新的腫瘤。抑制腫瘤轉(zhuǎn)移是我們治療腫瘤的重要途徑。因此，了解細(xì)胞遷移或侵襲機(jī)制會(huì)幫助我們更好的理解腫瘤細(xì)胞的散布機(jī)制并為腫瘤治療帶來新的契機(jī)

5、。探討Cyclin D1在遷移或侵襲中的作用可以給我們的研究指明新的方向。
　　 大量研究發(fā)現(xiàn)Cyclin D1在調(diào)節(jié)雌激素受體α(ERα)、雄激素受體(AR)等的轉(zhuǎn)錄活性時(shí)，必須要結(jié)合輔助激活因子或轉(zhuǎn)錄因子。因此我們推測(cè)Cyclin D1在細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移及腫瘤中的作用是通過結(jié)合特殊的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物而產(chǎn)生的。為了研究Cyclin D1結(jié)合蛋白在調(diào)節(jié)Cyclin D1功能中的作用，我們純化Cyclin D1結(jié)合蛋白復(fù)合物并發(fā)現(xiàn)了

6、神經(jīng)元蛋白激酶C酪蛋白激酶底物2(Proteinkinase C and casein kinase substrate in neurons protein2，PACSIN2)。PACSIN2是來源于雞心臟的52KDa粘合蛋白(FAP52)的同源體，它的家族成員在功能上被看作是細(xì)胞黏著斑中的胞漿輔助蛋白，參與囊泡的形成與運(yùn)輸。本課題就Cyclin D1與PACSIN2在影響細(xì)胞遷移中的作用進(jìn)行研究。
　　 一、發(fā)現(xiàn)并鑒定PAC

7、SIN是一種cyclin D1結(jié)合蛋白，并探討其結(jié)合機(jī)制
　　 目的：
　　 發(fā)現(xiàn)并鑒定出PACSIN2是一種Cyclin D1結(jié)合蛋白，探討PACSIN2是否可以特異性的結(jié)合Cyclin D1而非其他家族成員及其結(jié)合機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.通過免疫沉淀方法純化Cyclin D1結(jié)合蛋白，并經(jīng)過銀染電泳凝膠、凝膠片切除及消化過程，最后進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定分析和序列分析。
　　 2.將帶有Flag抗

8、原標(biāo)記的不同Cyclin D1質(zhì)粒DNA，包括野生型和突變型DNA，分別和帶有Myc抗原標(biāo)記的PACSIN2質(zhì)粒DNA，使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染的方法共轉(zhuǎn)于293T細(xì)胞。通過免疫沉淀-免疫印跡的方法分析該細(xì)胞。
　　 3.將帶有Flag抗原標(biāo)記的不同Cyclin D質(zhì)粒DNA，包括Cyclin D1，D2和D3及其突變型DNA，分別和帶有Myc抗原標(biāo)記的PACSIN2質(zhì)粒DNA，使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染的方法共轉(zhuǎn)于293T細(xì)胞。通過免疫沉淀-免疫印

9、跡的方法分析該細(xì)胞。
　　 4.將帶有Myc抗原標(biāo)記的不同PACSIN質(zhì)粒DNA，包括PACSIN1，PACSIN2和PACSIN3 DNA分別和帶有Flag抗原標(biāo)記的Cyclin D1質(zhì)粒DNA，使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染的方法共轉(zhuǎn)于293T細(xì)胞。通過免疫沉淀-免疫印跡的方法分析該細(xì)胞。
　　 5.將帶有Myc抗原標(biāo)記的不同PACSIN2質(zhì)粒DNA，包括野生型和變異型DNA，分別和帶有Flag抗原標(biāo)記的Cyclin D1質(zhì)粒DNA

10、，使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染的方法共轉(zhuǎn)于293T細(xì)胞。通過免疫沉淀.免疫印跡的方法分析該細(xì)胞。
　　 結(jié)果：
　　 1.通過純化Cyclin D1結(jié)合蛋白，得出CDK4(細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶)，70kD熱休克同源蛋白(Hsc70)和一種額外的蛋白質(zhì)。經(jīng)過質(zhì)譜測(cè)定分析和序列分析，鑒定出這種蛋白是PACSIN2。這種蛋白被看做是來源于雞心臟的52KDa粘合蛋白(FAP52)的同源體。
　　 2.敲除細(xì)胞周期蛋白的酸性氨基酸序列

11、后，Cyclin D1無法與PACSIN2結(jié)合。只有Cyclin D1和Cyclin D2可以與PACSIN2結(jié)合，但Cyclin D3、Cyclin D1b不能與其結(jié)合。
　　 3.免疫沉淀-免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PACSIN家族中只有PACSIN2可以和CyclinD1特異性的結(jié)合，PACSIN1和PACSIN3不能和Cyclin D1結(jié)合。
　　 4.通過敲除PACSIN2蛋白序列上NPF結(jié)構(gòu)域可以使得PACSIN2失去

12、與Cyclin D1結(jié)合的能力。
　　 結(jié)論：
　　 1.發(fā)現(xiàn)并鑒定出PACSIN2是可以與Cyclin D1特異性結(jié)合的Cyclin D1結(jié)合蛋白。
　　 2.Cyclin D1通過其羥基末端的E-rich基序與PACSIN2結(jié)合。
　　 3.PACSIN2通過其NPF結(jié)構(gòu)域與Cyclin D1結(jié)合。
　　 二.PACSIN2抑制正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的遷移能力。是通過與CyclinD1a結(jié)合而非C

13、yclin D1b實(shí)現(xiàn)的；
　　 目的：
　　 觀察Cyclin D1和PACSIN2在細(xì)胞中的蛋白結(jié)合共存位置，并確定作為CyclinD1結(jié)合蛋白的PACSIN2的生物學(xué)功能，以及其功能的發(fā)揮是否依賴于Cyclin D1。
　　 方法：
　　 1.在MRC5細(xì)胞(人胚胎肺成纖維細(xì)胞)中通過免疫組織化學(xué)染色方法觀察Cyclin D1和PACSIN2蛋白結(jié)合共存位置
　　 2.通過Transwell

14、 migration assay分析PACSIN2基因敲除型和野生型小鼠皮膚成纖維細(xì)胞遷移能力的區(qū)別。
　　 3.通過特異性siRNA降低LNCaP細(xì)胞(人前列腺癌細(xì)胞)中PACSIN2蛋白表達(dá)水平后，Transwell migration assay分析其遷移能力的變化。
　　 4.通過特異性siRNA降低3T3細(xì)胞(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)中PACSIN2蛋白表達(dá)水平后，Cell spreading assay觀察細(xì)胞伸

15、展能力的變化。
　　 5.分別在Cyclin D1敲除的小鼠上皮成纖維細(xì)胞Cyclin D1-/-細(xì)胞，以及該細(xì)胞經(jīng)過Cyclin D1a、Cyclin D1b質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)后的兩種細(xì)胞Cyclin D1-/-+D1a細(xì)胞和Cyclin D1-/-+D1b細(xì)胞中，使用特異性siRNA降低PACSIN2蛋白表達(dá)水平后，通過Transwell migration assay觀察細(xì)胞遷移能力的變化，Cell spreading ass

16、ay分析其伸展能力的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.MRC5細(xì)胞中，Cyclin D1和PACSIN2結(jié)合共存于細(xì)胞膜皺褶中。
　　 2.PACSIN2基因敲除后，小鼠皮膚成纖維細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)；PACSIN2siRNA可以增強(qiáng)人前列腺癌細(xì)胞LNCaP的遷移能力，降低小鼠胚胎成纖維細(xì)胞3T3細(xì)胞的伸展能力。
　　 3.PACSIN2 siRNA可以增強(qiáng)Cyclin D1-、-+D1a細(xì)胞的遷移能力，降低

17、細(xì)胞的伸展能力；但是在Cyclin D1-/-細(xì)胞和Cyclin D1-/-+D1b兩組細(xì)胞中沒有變化。
　　 結(jié)論：
　　 1.內(nèi)源性PACSIN2可以抑制人前列腺癌細(xì)胞和小鼠成纖維細(xì)胞的遷移能力，增強(qiáng)小鼠成纖維細(xì)胞的伸展能力。
　　 2.在Cyclin D1a存在的前提下，PACSIN2才能發(fā)揮其抑制細(xì)胞遷移、增強(qiáng)細(xì)胞伸展的能力。
　　 總之，作為Cyclin D1的結(jié)合蛋白，PACSIN2通過其結(jié)構(gòu)