c-Myc在噪聲條件下對(duì)耳蝸毛細(xì)胞的作用及分子機(jī)制.pdf

1、【背景】
　　隨著工業(yè)化進(jìn)程的加快，感音神經(jīng)性耳聾已逐漸成為影響公眾健康的重要社會(huì)問(wèn)題之一。過(guò)度的噪音暴露可導(dǎo)致內(nèi)耳機(jī)械性和代謝性損傷，嚴(yán)重影響了人類的生活質(zhì)量，并且最終可導(dǎo)致噪聲誘導(dǎo)的聽(tīng)力降低甚至缺失。然而，哺乳動(dòng)物耳蝸毛細(xì)胞為特化終末細(xì)胞，損失后其再生能力十分有限,這也是導(dǎo)致永久性聽(tīng)力損失的原因。因此，發(fā)現(xiàn)新的哺乳動(dòng)物內(nèi)耳調(diào)控基因，阻止誘導(dǎo)毛細(xì)胞凋亡的信號(hào)分子很可能為感音神經(jīng)性耳聾的治療帶來(lái)曙光。
　　原癌基因c-myc

2、是快速早期反應(yīng)基因，其編碼的細(xì)胞核蛋白調(diào)控細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期。通常認(rèn)為c-myc基因在許多生物過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，包括胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化及凋亡等。此外，據(jù)報(bào)道靜止細(xì)胞重返細(xì)胞周期過(guò)程中，c-myc基因起到募集轉(zhuǎn)錄因子的重要功能。該基因雖然如此重要，但在哺乳動(dòng)物耳蝸中的研究卻未見(jiàn)報(bào)道。因此，闡明c-myc基因在耳蝸中的作用為哺乳動(dòng)物耳蝸毛細(xì)胞再生提供新的思路。
　　【目的】
　　探討c-myc基因在噪聲條件下對(duì)豚

3、鼠聽(tīng)功能及耳蝸毛細(xì)胞形態(tài)的作用及其可能的分子機(jī)制。
　　【方法】
　　構(gòu)建含c-myc基因的腺病毒表達(dá)載體（Ad.c-myc-EGFP），并通過(guò)耳蝸冰凍切片觀察報(bào)告基因表達(dá)和Westernblot方法鑒定轉(zhuǎn)染后c-Myc表達(dá)量的變化。于噪聲暴露前4天通過(guò)耳蝸顯微注射術(shù)將Ad.c-myc-EGFP注射入豚鼠耳蝸鼓階內(nèi)，并以空白腺病毒載體（Ad.EGFP）做對(duì)照。將各組豚鼠暴露于110dBSPL的白噪聲，頻譜分析能量集中在0.2

4、5-6.4kHz，主要集中在4kHz左右，8h/day，連續(xù)7天。分別在噪聲暴露前及噪聲暴露后的第7天通過(guò)聽(tīng)性腦干反應(yīng)（ABR）檢測(cè)豚鼠聽(tīng)功能的情況，并利用基底膜鋪片和掃描電鏡等方法觀察耳蝸毛細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的變化。通過(guò)基因芯片和生物信息學(xué)分析進(jìn)一步探討噪聲對(duì)哺乳動(dòng)物內(nèi)耳基因表達(dá)譜的影響，并利用實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證基因芯片的結(jié)果；通過(guò)Tunel染色評(píng)估凋亡在噪聲性損傷中的作用；利用免疫組化方法觀察篩選到的目標(biāo)基因在耳蝸中的表達(dá)與定位，從

5、而推測(cè)c-myc基因在噪聲條件下可能發(fā)揮作用的分子機(jī)制。
　　【結(jié)果】
　　成功構(gòu)建了Ad.c-myc-EGFP腺病毒載體，并證明它可以有效干預(yù)耳蝸內(nèi)c-Myc蛋白的表達(dá)水平。通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察了c-myc基因?qū)Χ伒淖饔?，主要表現(xiàn)為：相同噪聲暴露后，Ad.c-myc-EGFP注射組聽(tīng)閾提高顯著低于Ad.EGFP組；Ad.c-myc-EGFP注射組外毛細(xì)胞形態(tài)改變及纖毛缺失率明顯低于Ad.EGFP注射組；掃描電鏡觀察亦表明Ad

6、.c-myc-EGFP注射組外毛細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷程度明顯小于Ad.EGFP對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步利用基因芯片探討噪聲所致內(nèi)耳分子的變化：噪聲可以導(dǎo)致539個(gè)基因發(fā)生變化，其中279個(gè)基因上調(diào)，260個(gè)基因下調(diào)。通過(guò)生物信息學(xué)分析：這些差異基因主要涉及免疫系統(tǒng)、應(yīng)激、生物代謝、節(jié)律調(diào)節(jié)及凋亡等相關(guān)基因。實(shí)時(shí)定量PCR鑒定了差異基因倍數(shù)大于5倍以上以及與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的基因，結(jié)果表明9種基因與基因芯片的趨勢(shì)相一致，上調(diào)的有Reg3b，Lcn2，

7、Nob1，Serpina3n，Hamp，Lbp，C3；下調(diào)的為Myh4，F(xiàn)2。Tunel染色觀察表明：噪聲可以誘導(dǎo)耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此，我們推測(cè)c-myc基因在噪聲條件下對(duì)豚鼠聽(tīng)力及耳蝸毛細(xì)胞損傷的推遲作用很可能是由于c-myc基因上調(diào)了保護(hù)性基因而下調(diào)了誘導(dǎo)耳蝸細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)而發(fā)揮作用，但c-myc基因與這9種分子在耳蝸細(xì)胞內(nèi)的具體調(diào)節(jié)方式及作用關(guān)系還有待進(jìn)一步闡明。此外，我們進(jìn)一步利用免疫組化觀察到No

8、b1基因編碼蛋白在噪聲暴露后大鼠耳蝸內(nèi)呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞主要集中在螺旋神經(jīng)節(jié)和內(nèi)、外毛細(xì)胞；血管紋細(xì)胞也有少量表達(dá)；而噪聲暴露前耳蝸內(nèi)未見(jiàn)Nob1蛋白的明顯表達(dá)。因此，推測(cè)Nob1基因作為轉(zhuǎn)錄因子可能參與耳蝸內(nèi)基因的調(diào)控，是一個(gè)新的內(nèi)耳調(diào)控基因，其作用及功能有待深入研究。
　　【結(jié)論】
　　c-myc基因減弱了噪聲誘導(dǎo)的豚鼠聽(tīng)功能損傷及毛細(xì)胞形態(tài)的改變，并可能通過(guò)調(diào)節(jié)Reg3b，Lcn2，Nob1，Serpina3n，Ha