Nob1在耳蝸毛細(xì)胞損傷中的作用研究.pdf

1、背景：
　　感音神經(jīng)性耳聾是導(dǎo)致言語(yǔ)交流障礙的一種常見(jiàn)疾病,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。盡管目前臨床上治療感音神經(jīng)性耳聾的策略有很多,但治療效果不佳。明確耳蝸細(xì)胞損傷的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò),尋找有效防治耳聾的目的基因,阻止誘導(dǎo)毛細(xì)胞凋亡的信號(hào)分子,成為未來(lái)耳聾基因治療新的方向。本研究團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)Nob1在哺乳動(dòng)物受損耳蝸細(xì)胞中高表達(dá),但這一表達(dá)變化的具體規(guī)律、機(jī)制及在感音神經(jīng)聾中所起的作用還不清楚。
　　目的：
　　本研究主要探尋

2、Nob1在出生后大鼠耳蝸內(nèi)的表達(dá)規(guī)律,擬利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)改變Nob1在耳蝸毛細(xì)胞中的表達(dá),借助體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究Nob1對(duì)耳蝸毛細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及與耳蝸毛細(xì)胞損傷之間的關(guān)系,以期證明Nob1基因是一個(gè)新的候選耳聾基因,為深入理解耳蝸毛細(xì)胞損傷的分子事件,探討新的治療方法奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　通過(guò)免疫組織熒光技術(shù)、Weatern-blot及實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),觀察Nob1在出生后大鼠耳蝸內(nèi)的表達(dá)規(guī)律。構(gòu)建含 Nob1基因

3、的慢病毒干擾載體(Nob1-RNAi-GFP-LV)以及腺病毒過(guò)表達(dá)載體(Ad5-Nob1-mCMV-EGFP),將病毒載體轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞系,上調(diào)以及下調(diào)Nob1基因表達(dá),探尋Nob1與凋亡之間的關(guān)系。在體外行離體耳蝸器官培養(yǎng),利用順鉑誘導(dǎo)離體耳蝸毛細(xì)胞損傷后,觀察 Nob1在毛細(xì)胞中的表達(dá)情況,并轉(zhuǎn)染慢病毒干擾載體(Nob1-RNAi-GFP-LV),用RT-PCR和Western blot鑒定病毒的轉(zhuǎn)染及Nob1表達(dá)情

4、況。最后在大鼠體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證Nob1在耳蝸毛細(xì)胞損傷中的作用,從耳蝸中階入路分別將Nob1-RNAi-GFP-LV干擾載體、慢病毒空載體和人工內(nèi)淋巴液注射入三組大鼠耳蝸,待RNAi發(fā)揮作用后,利用順鉑誘導(dǎo)大鼠耳蝸損傷,分別用ABR評(píng)估各組病毒載體注射前后大鼠聽(tīng)力變化;通過(guò)基底膜鋪片觀察毛細(xì)胞的形態(tài)變化,并采用全耳蝸毛細(xì)胞定量分析系統(tǒng)行耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù),Western-blot及實(shí)時(shí)定量PCR方法進(jìn)一步明確相關(guān)分子的表達(dá)變化。
　　結(jié)

5、果：
　　Nob1在大鼠耳蝸毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)元中有表達(dá),在細(xì)胞發(fā)育增殖分化高峰期比較弱,出生后隨著時(shí)間的增加而逐漸增強(qiáng)。當(dāng)毛細(xì)胞分化,內(nèi)外毛細(xì)胞形成,大、小上皮嵴開始分化形成各種支持細(xì)胞時(shí),Nob1表達(dá)較新生時(shí)期明顯增強(qiáng)。
　　我們成功構(gòu)建含Nob1基因的慢病毒干擾載體(Nob1-RNAi-GFP-LV)以及腺病毒過(guò)表達(dá)載體(Ad5-Nob1-mCMV-EGFP),在體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞系中成功上調(diào)及下調(diào)Nob1基因,通過(guò)流

6、式細(xì)胞儀檢測(cè)到上調(diào)Nob1表達(dá)后的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯高于下調(diào)Nob1基因表達(dá)組。
　　在體外培養(yǎng)的耳蝸器官組織中,通過(guò)低濃度順鉑成功誘導(dǎo)耳蝸毛細(xì)胞凋亡,發(fā)現(xiàn)Nob1在部分細(xì)胞核固縮的凋亡毛細(xì)胞細(xì)胞核中表達(dá),出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。隨著順鉑作用時(shí)間的增加,毛細(xì)胞的損傷逐漸加重,Nob1表達(dá)也逐漸增高,Western-blot結(jié)果與免疫組織熒光結(jié)果一致。在體外培養(yǎng)的耳蝸器官組織中,慢病毒干擾載體無(wú)法轉(zhuǎn)染至耳蝸毛細(xì)胞,只能轉(zhuǎn)染至螺旋神經(jīng)元。通過(guò)耳蝸

7、中階注射,將慢病毒干擾載體成功轉(zhuǎn)染至耳蝸外毛細(xì)胞、血管紋邊緣細(xì)胞及螺旋韌帶處。外淋巴內(nèi)可見(jiàn)少量慢病毒顆粒分布,而內(nèi)毛細(xì)胞處及螺旋神經(jīng)元處未見(jiàn)病毒分布。最后,在體內(nèi)慢病毒干擾可下調(diào)Nob1基因表達(dá),再給予順鉑誘導(dǎo)耳蝸毛細(xì)胞損傷后,與對(duì)照組相比,下調(diào)Nob1基因組的大鼠耳蝸聽(tīng)力閾值降低,耳蝸毛細(xì)胞損傷程度也降低。
　　結(jié)論：
　　Nob1可能通過(guò)凋亡信號(hào)分子通路參與了耳蝸器官的形成,在順鉑誘導(dǎo)的耳蝸毛細(xì)胞損傷中,Nob1可能參與