順鉑和慶大霉素對(duì)小鼠耳蝸毛細(xì)胞的毒性作用.pdf

1、目的：⑴探討順鉑不同給藥途徑對(duì)C57小鼠耳蝸毛細(xì)胞損傷的特點(diǎn)。⑵通過(guò)X連鎖凋亡蛋白抑制因子(XIAP)過(guò)度表達(dá)對(duì)慶大霉素耳毒性的拮抗作用闡明慶大霉素耳毒性與耳蝸毛細(xì)胞凋亡的關(guān)系。 方法：①鼠齡2月的成年C57BL/6J小鼠隨機(jī)分成5組：A組(n=6)耳蝸圓窗龕生理鹽水給藥5μl；B組(n=6)耳蝸圓窗龕順鉑給藥5μl(1mg/ml)；C組(n=6)經(jīng)鼓膜中耳腔順鉑一次性灌注0.1ml(1mg/ml)；D組(n=6)腹腔注射順鉑4

2、mg kg-1·d-1*4d；E組(n=8)腹腔一次性注射順鉑15mg/kg。應(yīng)用具有頻率特性的聽(tīng)覺(jué)腦干誘發(fā)電位(ABR)和畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)檢測(cè)5組動(dòng)物給藥前和給藥后10天的ABR反應(yīng)閾和畸變產(chǎn)物幅值(DP)，并以ABR反應(yīng)閾和DP幅值為指標(biāo)，評(píng)估各組動(dòng)物各頻率聽(tīng)覺(jué)靈敏度及耳蝸外毛細(xì)胞功能情況。所有動(dòng)物在第二次測(cè)試ABR和DPOAE后處死，行耳蝸琥珀酸脫氫酶染色及耳蝸基底膜鋪片，觀察用藥后毛細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化并繪制耳蝸毛細(xì)胞

3、圖。②應(yīng)用耳蝸基底膜分離取材及耳蝸器官離體培養(yǎng)技術(shù)，取出生后2-3天的C57BL/6J小鼠耳蝸基底膜行離體耳蝸器官培養(yǎng)，經(jīng)培養(yǎng)過(guò)夜后用不同濃度的慶大霉素培養(yǎng)液與離體基底膜共培養(yǎng)24或48小時(shí)。與0.1mM慶大霉素培養(yǎng)液共培養(yǎng)的部分基底膜培養(yǎng)24小時(shí)后，應(yīng)用FAM-peptide-FMK標(biāo)記的Caspase-3，Caspase-8，或Caspase-9指示劑作用1小時(shí)。再應(yīng)用熒光標(biāo)記的Phalloidin對(duì)全部耳蝸基底膜毛細(xì)胞的纖毛和表皮

4、板進(jìn)行染色。在熒光顯微鏡下定量觀察不同濃度慶大霉素對(duì)耳蝸毛細(xì)胞的損傷規(guī)律及caspases的表達(dá)情況。最后再利用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)所用小鼠進(jìn)行鑒定，區(qū)分同源野生型(Wild type，WT)小鼠和帶有6-Myc標(biāo)記的XIAP?；?TG)小鼠，并進(jìn)行兩組間的比較。 結(jié)果：⑴全身應(yīng)用順鉑的動(dòng)物，各頻率(2-32kHz) ABR反應(yīng)閾及DP幅值用藥前后無(wú)明顯變化(P>

5、0.05)，僅耳蝸基底膜鉤端毛細(xì)胞中等程度缺失；中耳腔及圓窗龕局部給藥導(dǎo)致從高頻到低頻的ABR反應(yīng)閾明顯升高和DP幅值明顯降低(P<0.05)，毛細(xì)胞出現(xiàn)損傷、脫落，其損傷從頂回到底回有逐漸加重的趨勢(shì)，外毛細(xì)胞較內(nèi)毛細(xì)胞損傷更加嚴(yán)重，聽(tīng)功能的變化和耳蝸毛細(xì)胞病理?yè)p傷基本一致。⑵在離體培養(yǎng)條件下，過(guò)度表達(dá)的XIAP對(duì)耳蝸毛細(xì)胞存活無(wú)明顯影響，野生型對(duì)照組和轉(zhuǎn)基因型小鼠耳蝸毛細(xì)胞均生長(zhǎng)良好，偶見(jiàn)內(nèi)外毛細(xì)胞散在性缺失。慶大霉素對(duì)耳蝸毛細(xì)胞的損

6、傷是劑量和時(shí)間依賴性的，隨著培養(yǎng)液中慶大霉素濃度的增加和共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，野生型和轉(zhuǎn)基因型小鼠耳蝸底回毛細(xì)胞缺失均逐漸向耳蝸?lái)?xiàng)回?cái)U(kuò)展。慶大霉素與基底膜共培養(yǎng)24小時(shí)，轉(zhuǎn)基因型小鼠與野生型對(duì)照小鼠耳蝸毛細(xì)胞損傷相似。0.1mM慶大霉素未引起耳蝸毛細(xì)胞的明顯缺失；0.25mM慶大霉素主要損害耳蝸中底回的內(nèi)外毛細(xì)胞，可引起全耳蝸約50％的內(nèi)外毛細(xì)胞缺失；0.5mM慶大霉素可引起全耳蝸約70％的內(nèi)外毛細(xì)胞缺損；1mM慶大霉素造成超過(guò)90％的內(nèi)外

7、毛細(xì)胞破壞。慶大霉素與基底膜共培養(yǎng)48小時(shí)，0.1mM慶大霉素引起野生型小鼠耳蝸中回約30％的毛細(xì)胞缺失以及耳蝸底回約60％的毛細(xì)胞缺失，而轉(zhuǎn)基因型小鼠耳蝸中回毛細(xì)胞缺失約15％，耳蝸底回毛細(xì)胞缺失約30％，兩型小鼠毛細(xì)胞存活數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；0.2mM硫酸慶大霉素引起的野生型和轉(zhuǎn)基因型小鼠毛細(xì)胞損失相似，底回毛細(xì)胞缺失近100％，頂回毛細(xì)胞缺失約20％?；啄づc0.1mM慶大霉素共培養(yǎng)24小時(shí)主要引起Caspase

8、-3，9的表達(dá)，過(guò)度表達(dá)的XIAP對(duì)caspase-3，9的表達(dá)有抑制作用。 結(jié)論：①順鉑不同給藥途徑導(dǎo)致C57小鼠耳蝸毛細(xì)胞損傷的特點(diǎn)各不相同。根據(jù)損傷特點(diǎn)的不同，中耳腔和圓窗龕局部給藥途徑可以用來(lái)建立順鉑誘發(fā)小鼠耳聾模型，但中耳腔給藥由于容易破壞中耳結(jié)構(gòu)而損傷聽(tīng)力，因此，在只關(guān)注內(nèi)耳形態(tài)學(xué)改變的實(shí)驗(yàn)中可以作為備選。②慶大霉素通過(guò)caspase途徑參與了耳蝸毛細(xì)胞凋亡的損傷，過(guò)度表達(dá)的XIAP可以拮抗慶大霉素的耳毒性，從而對(duì)耳