鹽酸椒苯酮胺對(duì)慶大霉素豚鼠耳蝸損傷保護(hù)作用及機(jī)制.pdf

1、聽(tīng)力障礙是一類常見(jiàn)疾病，嚴(yán)重影響著人類的身體健康和生活質(zhì)量，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)，全世界有輕度聽(tīng)力損失的人近6億，2.5億人患有中度以上聽(tīng)力損失，其中三分之二在發(fā)展中國(guó)家。而每出生700-1000個(gè)新生兒中，就有一個(gè)聽(tīng)障患兒[1]。中國(guó)是世界上最大的發(fā)展中國(guó)家，13億人口中聽(tīng)力障礙殘疾人就有2780萬(wàn)，為各類殘疾之首。能否找到有效的方法預(yù)防和治療聽(tīng)力障礙，是我們共同面臨的巨大挑戰(zhàn)。聽(tīng)力障礙分傳導(dǎo)性、感音神經(jīng)性和混合性，絕大部分為

2、感音神經(jīng)性。感音神經(jīng)性聾是耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)中常見(jiàn)病，是內(nèi)耳及其神經(jīng)傳導(dǎo)通路一系列病變所致聽(tīng)力損失的總稱，發(fā)病原因有遺傳性、缺血性、耳毒性、感染性、老年性、噪聲性、創(chuàng)傷性、代謝性、自身免疫、突發(fā)或特發(fā)性、中樞性、聽(tīng)神經(jīng)病、腫瘤、功能性等，其中以缺血、病毒感染、耳毒性藥物中毒及老年性退行性變等最常見(jiàn)。病理改變主要是耳蝸毛細(xì)胞損傷、螺旋神經(jīng)節(jié)、支持細(xì)胞及神經(jīng)末梢的器質(zhì)性改變以及耳蝸神經(jīng)、腦干聽(tīng)覺(jué)通路及聽(tīng)覺(jué)中樞病變或受損。耳蝸內(nèi)包含兩種類型感

3、覺(jué)細(xì)胞:內(nèi)毛細(xì)胞(IHC)和外毛細(xì)胞(OHC)，它們負(fù)責(zé)將聲音轉(zhuǎn)化為電信號(hào)進(jìn)行傳遞，這些信號(hào)經(jīng)過(guò)螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(SGC)換元傳遞到聽(tīng)覺(jué)腦干通路。而這些IHC、OHC和SGC都缺乏再生的能力，因此，耳蝸的任何損傷都會(huì)導(dǎo)致不可逆的聽(tīng)力損失。在耳蝸損傷所導(dǎo)致的聽(tīng)力障礙里，耳毒性藥物所致?lián)p傷是當(dāng)前臨床治療上的難題，眾多研究圍繞其發(fā)病機(jī)制及治療展開(kāi)，希望可以為臨床治療耳毒性藥物損傷提供更好的方法。關(guān)于藥物性損傷的機(jī)制，目前多認(rèn)為與自由基損傷、鈣

4、離子超載等有關(guān)[2]，其中氨基糖苷類所致的耳毒性感音神經(jīng)性聾屬于臨床中常見(jiàn)的類型。
　　 氨基糖苷類抗生素(AmAn)具有抗菌譜廣、殺菌抑菌作用強(qiáng)、價(jià)格便宜等許多適用于臨床使用的優(yōu)點(diǎn)，但因其具有耳毒性、腎毒性等嚴(yán)重的不良反應(yīng)，限制了臨床應(yīng)用，在短期應(yīng)用AmAn治療的病例中，耳毒性發(fā)生率為20％，而在治療結(jié)核及其他嚴(yán)重細(xì)菌（尤其是革蘭陰性細(xì)菌）感染的長(zhǎng)期應(yīng)用中，耳毒性發(fā)生率可高達(dá)80％[3]。近年來(lái)由于結(jié)核和其他新的感染性疾病如抗

5、艾滋病的發(fā)生率增高，使AmAn又有新的應(yīng)用。有研究表明AmAn可與HIV中的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白應(yīng)答因子(RRE)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使HIV的RRE.Rev(逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白)相互作用產(chǎn)生抑制，從而具有阻遏HIV復(fù)制的活性[4]，使得AmAn的很多應(yīng)用不可替代。屬于氨基糖苷類抗生素的慶大霉素(GM)是由絳紅小單孢菌、棘孢小單孢菌等發(fā)酵產(chǎn)生的一種殺菌力較強(qiáng)的廣譜抗菌素，目前被廣泛用于臨床。GM由于廉價(jià)抗菌譜廣，在臨床廣泛應(yīng)用，以至出現(xiàn)了不少致感

6、音神經(jīng)性聾的病例[5,6]。同時(shí)，因GM的肝腎毒性較其他AmAn小，使其成為是實(shí)驗(yàn)研究中制造感音神經(jīng)性聾動(dòng)物模型的理想藥物。
　　 GM在機(jī)體內(nèi)的藥理學(xué)分布特點(diǎn)是不易進(jìn)入胞內(nèi)，不易透入關(guān)節(jié)腔，也不易透過(guò)血腦屏障，其主要集中在細(xì)胞外液，特別是內(nèi)耳淋巴液。慶大霉素的內(nèi)耳淋巴液的蓄積[7]構(gòu)成了其耳毒性的生理基礎(chǔ)，機(jī)制較為復(fù)雜，一直是國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。目前認(rèn)為內(nèi)耳毛細(xì)胞受損與氧有自由基、鈣超載和啟動(dòng)凋亡等相關(guān)。氧自由基主要通過(guò)

7、一系列的過(guò)氧化反應(yīng)造成組織細(xì)胞的損傷，往往損害細(xì)胞膜磷脂分子中不飽和脂肪酸的過(guò)氧化，最終使生物膜受到嚴(yán)重?fù)p傷[8]。郭玉芬等[9]證實(shí)聚天冬氨酸酶對(duì)慶大霉素致耳蝸組織氧自由基的產(chǎn)生有抑制作用，從而拮抗了慶大霉素所致耳蝸毒性的發(fā)生。McFadden[10]等已證實(shí)一種超氧化物歧化酶的類似物，可防止由慶大霉素引起的毛細(xì)胞損傷。氧自由基和鈣超載除直接造成細(xì)胞損傷外還可導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[11]。也有學(xué)者證明，細(xì)胞凋亡是氨基糖苷類抗生素致聾的主要方

8、式，細(xì)胞凋亡的“瀑布式”級(jí)聯(lián)反應(yīng)主要有兩條途徑:①細(xì)胞外途徑，即死亡受體途徑。②細(xì)胞內(nèi)途徑，研究比較多的是線粒體途徑。但兩種途徑最終都依賴于Caspase-3的活化，caspase-3在凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中處于核心地位，是凋亡的最終執(zhí)行者[12]。Shimizu等[13,14]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)凋亡抑制劑——鈣蛋白酶和半胱天冬酶抑制劑可以阻止AmAn耳毒性的產(chǎn)生，促進(jìn)前庭毛細(xì)胞的存活，表明凋亡與AmAn前庭耳毒性有著緊密關(guān)系。
　　 目前臨

9、床上仍然缺乏治愈感音神經(jīng)性聽(tīng)力障礙和保護(hù)聽(tīng)覺(jué)功能的有效的方法。雖然近年來(lái)一些研究報(bào)道了哺乳動(dòng)物甚至人的內(nèi)耳前庭及耳蝸毛細(xì)胞在受傷后可能再生，但哺乳動(dòng)物OHC、IHC和SGC再生的在體試驗(yàn)尚未取得成功。有研究提出耳聾基因概念，認(rèn)為耳聾與線粒體DNA突變有關(guān)，發(fā)現(xiàn)tRNAlleA4317G同質(zhì)性突變，確認(rèn)A1555G和C1494T突變與感音神經(jīng)性耳聾和氨基糖甙類耳聾有關(guān)[15]。上述研究停留在實(shí)驗(yàn)階段，尚未展開(kāi)臨床應(yīng)用。感音神經(jīng)性耳聾多數(shù)治

10、療效果不佳，大多數(shù)藥物治療無(wú)效的患者只能選擇配戴助聽(tīng)器或行人工耳蝸植入術(shù)。當(dāng)前人工耳蝸植入術(shù)可以贗復(fù)重度的感音神經(jīng)性耳聾，但價(jià)格昂貴。所以，探索對(duì)各種因素導(dǎo)致內(nèi)耳損傷的早期干預(yù)和有效治療藥物就顯得尤為重要。
　　 由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所自主創(chuàng)新研制的化合物鹽酸椒苯酮胺(PPTA)，3個(gè)發(fā)明專利已獲授權(quán)，2個(gè)國(guó)內(nèi)[16]和1個(gè)國(guó)際PCT發(fā)明專利已申請(qǐng)。2008年獲11類化學(xué)藥品臨床試驗(yàn)批件[17]并已完成127例Ⅰ期臨床試驗(yàn)[

11、18]。臨床前研究提示其具有清除再灌注損傷時(shí)自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的作用[19]。徐江平研究PPTA對(duì)腦細(xì)胞受損所產(chǎn)生的氧自由基具有清除作用，可增加SOD活力和GSH含量[20]。也有實(shí)驗(yàn)表明PPTA有抗鈣超載的作用[21-23]，對(duì)心肌損傷線粒體有明顯的保護(hù)作用。PPTA也可使線粒體膜流動(dòng)性保持正常，明顯減輕線粒體的超微結(jié)構(gòu)損傷[24]。而氧自由基和鈣超載往往導(dǎo)致機(jī)體大多數(shù)組織和細(xì)胞損傷，而線粒體的損傷又可活化Caspase-3啟

12、動(dòng)細(xì)胞凋亡。有研究表明PPTA具有顯著降低Caspase-3 mRNA的表達(dá)，表現(xiàn)出良好的抗調(diào)亡作用[25]。這為PPTA用于感音神經(jīng)性耳聾的干預(yù)和治療奠定了基礎(chǔ)。
　　 本研究以慶大霉素的耳毒性制造耳蝸損傷豚鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用鼓階開(kāi)窗微孔注入技術(shù)和腹腔注射方法，觀察PPTA對(duì)耳蝸的保護(hù)作用，通過(guò)聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)、免疫組化(IHC)、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)、蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)(Wes

13、tem blot)、掃描電鏡(SEM)等方法，透射電鏡(TEM)等方法檢測(cè)ABR RT、PL、T-SOD、GSH、Caspase-3等指標(biāo)及凋亡和壞死等形態(tài)學(xué)變化，探討GM的耳毒性機(jī)理及PPTA對(duì)耳蝸損傷的保護(hù)機(jī)制，為感音神經(jīng)性聾藥物治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 本研究分為以下三個(gè)部分:
　　 第一部分慶大霉素致豚鼠耳蝸損傷模型和鼓階開(kāi)窗微孔注入技術(shù)的建立
　　 目的:建立慶大霉素制造豚鼠的耳蝸損傷模型和鼓階開(kāi)窗

14、微孔注入技術(shù)，探討在模型豚鼠上ABR的應(yīng)用及聽(tīng)力學(xué)特征，并研究經(jīng)鼓階開(kāi)窗手術(shù)對(duì)聽(tīng)力和耳蝸組織的影響。方法:聽(tīng)力正常實(shí)驗(yàn)級(jí)豚鼠30只，隨機(jī)分為三組: A組(Controlgroup):10只，生理鹽水，等量，每日稱重，按體重計(jì)算用量，肌注，28d;B組(GM group):10只，硫酸慶大霉素注射液，120mg/(kg·d)，每日稱重，按體重計(jì)算用量，肌注，28d。C組(Fenestration group):10只，左耳行鼓階開(kāi)窗微孔注

15、入手術(shù)，注入人工外淋巴液，正常飼養(yǎng)7d。A、B兩組GM前1h及第28天測(cè)ABR;A、C兩組術(shù)前及術(shù)后7d測(cè)ABR。數(shù)據(jù)以(x)±S表示，采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)實(shí)驗(yàn)前后數(shù)據(jù)進(jìn)行協(xié)方差分析，若實(shí)驗(yàn)前ABR反應(yīng)閾對(duì)試驗(yàn)后ABR無(wú)影響，則用獨(dú)立樣本t-test檢驗(yàn)兩組前后差異，用配對(duì)樣本t-test檢驗(yàn)同一組前后差異。結(jié)束后將A，B，C組豚鼠斷頭取聽(tīng)泡，行掃描電鏡(SEM)形態(tài)學(xué)觀察、免疫組化(IHC)細(xì)胞染色觀察。結(jié)果:

16、用藥28天后，GM組比正常組ABRRT顯著升高(t=18.108，P＜0.001);經(jīng)鼓階開(kāi)窗微孔注入術(shù)7天后，C組和正常組ABR RT無(wú)顯著差異(t=0.000，P=1.000)。IHC及SEM觀察見(jiàn)GM組毛細(xì)胞纖毛倒伏、斷裂、細(xì)胞缺失，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮、棕染等，A組及C組未見(jiàn)這些現(xiàn)象。結(jié)論:慶大霉素可以建立穩(wěn)定的感音神經(jīng)性聾動(dòng)物模型;慶大霉素耳毒性體現(xiàn)在RT提高，耳蝸OHC、IHC、SGC、SV細(xì)胞壞死及凋亡;通過(guò)豚鼠耳蝸鼓階鉆孔開(kāi)窗

17、，微孔注入手術(shù)后對(duì)豚鼠聽(tīng)力及耳蝸組織沒(méi)有產(chǎn)生明顯影響。
　　 第二部分鼓階微孔注入PPTA對(duì)慶大霉素豚鼠耳蝸損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制研究
　　 目的:將PPTA經(jīng)鼓階開(kāi)窗微孔注入技術(shù)注入豚鼠耳蝸，研究其對(duì)慶大霉素耳毒性的拮抗作用及氧自由基機(jī)制。方法:聽(tīng)力正常豚鼠45只，分為三組:A組(Controlgroup)15只，以等量生理鹽水肌肉注射，連續(xù)3d;B組(GM group)15只，以GM160 mg/kg.d，肌肉注射

18、，連續(xù)3d;C組(PPTA+GM group)15只，以GM160mg/kg.，3d，每日GM1小時(shí)前，行雙側(cè)鼓階開(kāi)窗微孔技術(shù)注入PPTA(濃度2mg/ml)10μl。（注:每組都以10只做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，額外為掃描電鏡做形態(tài)學(xué)觀察用）。三組動(dòng)物分別在用藥前，第3天用藥后測(cè)ABR。在最后一次測(cè)ABR每組取10只迅速斷頭取聽(tīng)泡取左側(cè)耳蝸(n=10)行T-SOD活力檢測(cè)，取右側(cè)耳蝸(n=10)行GSH含量檢測(cè);各組ABR RT、T-SOD、GS

19、H統(tǒng)計(jì)使用SPSS13.0分析軟件，數(shù)據(jù)以(x)±S表示，用協(xié)方差分析處理數(shù)據(jù)，若實(shí)驗(yàn)前ABR反應(yīng)閾對(duì)實(shí)驗(yàn)后無(wú)影響，對(duì)試驗(yàn)后數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。每組剩余5只豚鼠耳蝸行掃描電鏡(SEM)形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果:用藥3d后，GM組ABR RT顯著高于正常組(P＜0.05)，GM組T-SOD活力、GSH含量顯著顯著低于GM+PPTA組(P＜0.05);經(jīng)鼓階開(kāi)窗微孔技術(shù)注入PPTA3d后，PPTA+GM組ABRRT明顯高于Control組(P＜

20、0.05)，但顯著低于GM組(P＜0.05)。PPTA+GM組比GM組及正常組T-SOD活力、GSH含量顯著低于正常組(P＜0.05)，但顯著高于GM組(P＜0.05)。SEM觀察見(jiàn):GM后毛細(xì)胞纖毛倒伏、斷裂、細(xì)胞缺失等，PPTA+GM組亦有此現(xiàn)象，但較GM組輕微，正常組未見(jiàn)這些現(xiàn)象。結(jié)論:促耳蝸組織內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量OFR造成耳蝸組織細(xì)胞損傷，是GM耳毒性的一個(gè)重要原因。經(jīng)鼓階開(kāi)窗微孔技術(shù)注入PPTA可拮抗GM所致聽(tīng)力和耳蝸組織損傷;PPT

21、A可以通過(guò)清除耳蝸組織內(nèi)氧自由基和增強(qiáng)抗氧化能力從而發(fā)揮耳蝸保護(hù)作用。
　　 第三部分腹腔注入PPTA對(duì)慶大霉素豚鼠耳毒性拮抗作用及對(duì)耳蝸組織Caspase-3表達(dá)的影響
　　 目的:研究PPTA全身給藥對(duì)慶大霉素耳毒性的拮抗作用及相關(guān)機(jī)制。方法:聽(tīng)力正常豚鼠45只，分為三組:A組(Control group)15只，以等量生理鹽水肌肉注射，連續(xù)14d;B組(GM group)15只，GM120 mg/kg.d，肌肉注射

22、，連續(xù)14 d;C組(PPTA+GM group)15只，PPTA10 mg/kg.d腹腔注射+GM120mg/kg.d（1h后），肌注，連續(xù)14d。三組動(dòng)物在用藥前1h，第14天用藥后測(cè)ABR。在最后一次測(cè)ABR后所有動(dòng)物迅速斷頭取聽(tīng)泡，以左側(cè)耳蝸(n=10)行Western blot檢測(cè)Caspase-3表達(dá)，統(tǒng)計(jì)使用SPSS13.0分析軟件，數(shù)據(jù)以(x)±S表示，用協(xié)方差分析處理數(shù)據(jù)，若實(shí)驗(yàn)前ABR反應(yīng)閾對(duì)實(shí)驗(yàn)后無(wú)影響，對(duì)試驗(yàn)后數(shù)

23、據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。以右側(cè)耳蝸行TUNEL染色，每組剩余5只一側(cè)耳做掃描電鏡另一側(cè)耳做透射電鏡觀察。結(jié)果:GM組、PPTA+GM組ABR RT顯著高于Control組(P＜0.05)，PPTA+GM組ABR RT顯著低于GM組;Western blot結(jié)果表明用藥后GM組豚鼠caspase-3表達(dá)顯著增加(P＜0.001);PPTA+GM組caspase-3的表達(dá)顯著高于Control組但顯著低于GM組(P＜0.001)。SEM，TE

24、M和TUNEL觀察見(jiàn):GM組毛細(xì)胞損傷嚴(yán)重，耳蝸Corti器、側(cè)壁的血管紋和螺旋神經(jīng)節(jié)存在陽(yáng)性細(xì)胞，出現(xiàn)了凋亡和壞死的形態(tài)學(xué)特征;而PPTA+GM組損傷較GM組明顯減輕;Control組未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞。
　　 結(jié)論:慶大霉素耳毒性所致耳蝸組織損傷中，凋亡與壞死并存，GM通過(guò)caspase-3途徑參與了耳蝸細(xì)胞凋亡;PPTA具有拮抗GM耳毒性所致的耳蝸功能和結(jié)構(gòu)損傷的作用;PPTA通過(guò)降低caspase-3蛋白表達(dá)，抑制凋亡，從而對(duì)