鹽酸雙苯氟嗪對(duì)缺血-再灌注性腦損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目前，臨床上急性腦卒中的主要治療手段是溶栓，但溶栓后的再灌注往往會(huì)加劇腦損傷，因此急需研究和開發(fā)能有效對(duì)抗缺血再灌注性腦損傷的藥物。鹽酸雙苯氟嗪是由河北醫(yī)科大學(xué)首創(chuàng)合成的一個(gè)新型的桂利嗪類衍生物。本實(shí)驗(yàn)室已通過(guò)生理、生化及形態(tài)學(xué)等多種技術(shù)從不同角度證明雙苯氟嗪對(duì)缺血/再灌注性腦損傷有明顯的保護(hù)作用。但是由于雙苯氟嗪較難溶于水，不方便臨床上腦卒中病人使用。所以我們將其制成鹽酸鹽，增加了其在水中溶解度，使其注射液可直接血管內(nèi)給藥。本研究擬在

2、整體動(dòng)物水平與細(xì)胞水平建立缺血再灌注腦損傷模型，觀察鹽酸雙苯氟嗪對(duì)缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用，并進(jìn)一步探討其保護(hù)機(jī)制。
　　第一部分鹽酸雙苯氟嗪對(duì)大鼠局灶性缺血再灌注所致腦損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究
　　目的：評(píng)價(jià)鹽酸雙苯氟嗪在大鼠局灶性缺血再灌注所造成的腦損傷中的保護(hù)作用及其機(jī)制
　　方法：大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，溶劑對(duì)照組，鹽酸雙苯氟嗪組2.5μmol/kg組，鹽酸雙苯氟嗪1.3μmol/kg組，鹽酸雙苯氟嗪0.7μm

3、ol/kg，氟桂利嗪(Flu)1.3μmol/kg組。采用線栓法制備大鼠局灶性缺血再灌注模型，各組在缺血再灌注的同時(shí)尾靜脈注射給藥，給藥容積為0.2ml/100g。假手術(shù)組只行手術(shù)通路，不插線栓不給藥。缺血2h再灌4h后測(cè)定神經(jīng)癥狀、腦含水量、血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量，采用HE染色法光鏡下觀察組織病理變化，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)AQP-4蛋白的表達(dá)，以評(píng)價(jià)鹽酸雙苯氟嗪對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，并探討

4、其可能的機(jī)制。
　　結(jié)果：(1)神經(jīng)功能評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠未產(chǎn)生神經(jīng)功能損傷，溶劑組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分為9.50±0.22，有明顯損傷(P＜0.01)。鹽酸雙苯氟嗪大、中劑量組和Flu組與溶劑組相比有明顯下降(P＜0.01)，大鼠神經(jīng)功能評(píng)分分別降至6.50±0.96、7.33±0.94和7.66±0.42。(2)腦含水量測(cè)定結(jié)果顯示，缺血再灌注損傷后腦組織含水量明顯升高至82.24±0.23％，藥物干預(yù)后，鹽酸雙苯氟嗪各劑

5、量組與Flu組大鼠腦含水量有明顯降低，分別為大劑量組78.96±0.95％、中劑量組79.95±0.47％、小劑量組81.08±0.40和Flu組79.41±0.65％，抗腦水腫效果明顯。(3)血清中SOD活性與MDA含量測(cè)定結(jié)果顯示，缺血再灌注損傷后血清中SOD活性明顯下降至24.86±0.86 U/ml，MDA含量明顯升高至6.11±0.05nm/ml，給予鹽酸雙苯氟嗪干預(yù)后，可減輕以上損傷，其中大劑量鹽酸雙苯氟嗪作用最為明顯，SO

6、D活性提高至61.79±1.09 U/ml，MDA含量下降為4.64±0.05 nm/ml。(4)HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠神經(jīng)細(xì)胞未見(jiàn)明顯病變。溶劑組大鼠缺血側(cè)大腦皮層、紋狀體和海馬區(qū)出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)細(xì)胞變性壞死，胞體固縮，核濃縮深染，細(xì)胞與周圍組織形成明顯的間隙，出現(xiàn)空泡變性。高中低三個(gè)劑量的鹽酸雙苯氟嗪可以劑量依賴性明顯改善上述病變。(5)免疫組化檢測(cè)AQP-4蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，AQP4主要在血管周圍的膠質(zhì)細(xì)胞有陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)部

7、位為細(xì)胞膜。假手術(shù)組膠質(zhì)細(xì)胞僅有少量AQP-4的表達(dá)，缺血再灌注以后梗死周邊區(qū)域AQP-4的表達(dá)則明顯增多。鹽酸雙苯氟嗪大劑量組(4.60±0.31)、鹽酸雙苯氟嗪中劑量組(6.10±0.37)以及Flu組(5.70±0.47)膠質(zhì)細(xì)胞的AQP-4表達(dá)與溶劑組相比均有顯著減少(P＜0.01)。
　　結(jié)論：鹽酸雙苯氟嗪能夠通過(guò)清除自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化及減少梗死周邊區(qū)域AQP-4的表達(dá)而減輕腦水腫程度，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第

8、二部分鹽酸雙苯氟嗪對(duì)糖氧剝奪/復(fù)氧所致海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究
　　目的：評(píng)價(jià)鹽酸雙苯氟嗪在糖氧剝奪/復(fù)氧所致海馬神經(jīng)元損傷中的保護(hù)作用以及機(jī)制研究
　　方法：體外培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元，7-8天成熟后，細(xì)胞隨機(jī)分為12h-R24h組、14h-R24h組、16h-R24h組、18h-R24h組，通過(guò)MTT比色法測(cè)定細(xì)胞存活率，確定使用16h-R24h作為糖氧剝奪/復(fù)氧模型。經(jīng)16h-R24h損傷后的細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照

9、組、溶劑對(duì)照組、鹽酸雙苯氟嗪10μmol/L組、鹽酸雙苯氟嗪1μmol/L組、鹽酸雙苯氟嗪0.1μmol/L組和氟桂利嗪(Flu)1μmol/L組。分別測(cè)定各組神經(jīng)元細(xì)胞MTT OD值、LDH漏出、胞內(nèi)鈣離子濃度、NO含量、NOS活性、細(xì)胞凋亡率，以評(píng)價(jià)鹽酸雙苯氟嗪的保護(hù)作用并研究其機(jī)制。
　　結(jié)果：(1)經(jīng)不同濃度鹽酸雙苯氟嗪干預(yù)的細(xì)胞，MTT測(cè)定的OD值明顯增高，顯示細(xì)胞活性升高，LDH漏出顯著降低，表示細(xì)胞受損程度減小。(2

10、)糖氧剝奪/復(fù)氧可致海馬神經(jīng)元胞漿內(nèi)鈣離子超載，鹽酸雙苯氟嗪可減輕由糖氧剝奪/復(fù)氧所致的海馬神經(jīng)元鈣超載，其中高濃度組(238.50±7.73)與溶劑組(319.40±10.79)相比有顯著性差異(P＜0.01)。(3)糖氧剝奪/復(fù)氧損傷會(huì)使細(xì)胞NO含量與NOS活性都明顯升高，不同濃度的鹽酸雙苯氟嗪與Flu能夠不同程度的改善此種損傷變化。(4)原位凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組細(xì)胞可見(jiàn)有少量凋亡細(xì)胞(41.30±1.78)，糖氧剝奪/復(fù)氧