椒苯酮胺對(duì)全腦缺血-再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用.pdf

1、目的:缺血性腦卒中(ischemicstroke)是由于血栓或動(dòng)脈栓塞引起的腦血容量不足而出現(xiàn)的一過性腦病。腦缺血啟動(dòng)一系列生化分子機(jī)制，包括興奮性氨基酸毒性、離子失衡以及自由基反應(yīng)等等，最終造成腦功能失調(diào)。這一病理過程中，缺血時(shí)間和腦組織的耐受性顯得至關(guān)重要，有研究報(bào)道大鼠遭受20至30min的全腦缺血就可以導(dǎo)致腦組織損傷。神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)低氧或低糖較為敏感，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元已被證實(shí)是缺血最易損傷的區(qū)域，10min的短暫缺血就可以造成7

2、1.6％的神經(jīng)元壞死和空間學(xué)習(xí)記憶能力的缺失。腦缺血所導(dǎo)致的認(rèn)知功能損害成為了腦卒中患者急需解決的一大難題。
　　 鹽酸椒苯酮胺(Piperphentonaminehydrochloride，PPTA;化學(xué)名稱:(E)-5-{（3，4-亞甲二氧基苯乙基）甲氨基}-1-對(duì)羥基苯基-1-戊烯-3-酮鹽酸鹽）為一用來治療心力衰竭和缺血性心臟病的新型鈣增敏劑類藥物，其藥效與已上市的心血管藥物levosimendan相似。近期研究報(bào)道了l

3、evosimendan呈劑量依賴性地減輕創(chuàng)傷性腦損傷，進(jìn)而提供神經(jīng)保護(hù)作用?，F(xiàn)有的藥效學(xué)資料顯示:PPTA具有不增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、可通過增大血管平滑肌細(xì)胞鈣敏感鉀通道電流產(chǎn)生舒血管作用的特點(diǎn)。同時(shí)，PPTA在貓和大鼠的心肌缺血/再灌注損傷模型上具有良好的抗缺血作用?；诖?，我們假設(shè)PPTA不僅能給缺血心肌提供保護(hù)作用，還能夠減輕缺血對(duì)腦組織造成的損傷。因此，本實(shí)驗(yàn)建立大鼠全腦缺血/再灌注損傷模型，觀察PPTA對(duì)大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元損傷情

4、況及學(xué)習(xí)記憶能力的影響;同時(shí)建立體外海馬神經(jīng)元和PC12細(xì)胞氧糖剝奪損傷(oxygen-glucosedeprivation，OGD)模型，觀察PPTA對(duì)細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞活力的影響。
　　 方法:(1)采用Pulsinelli四血管法(4-vessel-occlusion，4-VO)制作全腦缺血模型。健康雄性SD大鼠，造模成功后隨機(jī)分為正常對(duì)照組、缺血再灌組(I/R)、PPTA劑量組(2.5、5、10mg/kg)。再灌注2h腹腔注

5、射給藥。Morris水迷宮和避暗實(shí)驗(yàn)測定大鼠學(xué)習(xí)記憶能力;病理切片Nissl染色觀察海馬神經(jīng)元細(xì)胞丟失情況;試劑盒檢測海馬勻漿乳酸脫氫酶(Lactatedehydrogenase，LDH)的含量;Real-timePCR檢測海馬誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、bcl-2以及bax基因表達(dá)情況。(2)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元和PC12細(xì)胞，分別采用物理和化學(xué)兩種方法建立細(xì)胞氧糖剝奪損傷模型，觀察細(xì)胞

6、形態(tài)學(xué)變化;四甲基偶氮唑藍(lán)(methylthiazolyltetrazolium，MTT)法檢測不同濃度PPTA對(duì)細(xì)胞活力的影響;測定細(xì)胞外液LDH和NO的濃度;Real-timePCR檢測細(xì)胞iNOS、caspase-3、bcl-2及bax基因表達(dá)情況;Westernblot測定iNOS蛋白水平。
　　 結(jié)果:1、大鼠全腦缺血/再灌注損傷實(shí)驗(yàn)
　　 (1)Morris水迷宮定向航行試驗(yàn)中，隨著學(xué)習(xí)時(shí)間的延長，各組大鼠的

7、逃避潛伏期均有所減少，從d3開始出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表現(xiàn)為模型組大鼠較假手術(shù)組顯著延長，PPTA5和10mg/kg組較模型組顯著減少。這說明全腦缺血損傷造成大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降，而給予PPTA藥物治療后能夠改善大鼠記憶缺失的情況。空間探索試驗(yàn)中，假手術(shù)組探索時(shí)間顯著長于模型組，除PPTA2.5mg/kg組無顯著性差異外，PPTA5和10mg/kg組與模型組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中各組大鼠的游泳速度沒有出現(xiàn)顯著性差異，這表明

8、大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的缺失與自身原因無關(guān)，同時(shí)PPTA能增強(qiáng)術(shù)后大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。避暗實(shí)驗(yàn)中，由于大鼠的趨暗習(xí)性，表現(xiàn)為訓(xùn)練時(shí)期各組大鼠進(jìn)入暗箱的時(shí)間沒有顯著性差異，假手術(shù)組遭受電擊24h后潛伏期顯著延長，顯示大鼠對(duì)電擊損傷形成記憶;而模型組大鼠較假手術(shù)組顯著縮短，PPTA5和10mg/kg組能有效地緩解缺血大鼠的長時(shí)記憶缺失。(2)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠海馬進(jìn)行Nissl染色，假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)完整，著色均一，排列緊

9、密而有規(guī)則;模型組少見形態(tài)規(guī)則細(xì)胞，核固縮深染，排列紊亂;給予PPTA后海馬神經(jīng)元損傷顯著減少，表現(xiàn)為PPTA5和10mg/kg組可見形狀規(guī)則、胞漿完整的錐體細(xì)胞，神經(jīng)元細(xì)胞密度顯著升高。(3)全腦缺血損傷后大鼠腦組織內(nèi)LDH水平顯著升高;PPTA5和10mg/kg組可顯著降低海馬LDH水平。(4)Real-timePCR結(jié)果顯示PPTA中高劑量組能不同程度的下調(diào)caspase-3，bax和iNOS基因的表達(dá)，上調(diào)促凋亡基因bcl-2的

10、表達(dá)。
　　 2、離體神經(jīng)元氧糖剝奪損傷實(shí)驗(yàn)
　　 (1)PC12細(xì)胞采用20mmol/LNa2S2O4誘導(dǎo)，氧糖剝奪4h再復(fù)氧24h;原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞采用物理缺氧建模。MTT結(jié)果顯示:OGD損傷后細(xì)胞活力顯著下降，PPTA處理組（3，6和12μmol/L）能顯著提高細(xì)胞活力，并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。(2)OGD損傷后，PC12細(xì)胞和原代海馬培養(yǎng)上清液中LDH和NO的含量顯著增加;PPTA處理組能減輕細(xì)胞損傷。(3)

11、形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)OGD損傷后神經(jīng)元細(xì)胞形狀變圓、突觸減少或消失，以及細(xì)胞數(shù)量顯著減少，而PPTA處理后這一損傷顯著減輕。(4)Real-timePCR的結(jié)果顯示:PPTA能夠降低OGD誘導(dǎo)的抗凋亡基因bcl-2降低、促凋亡基因bax，caspase-3以及iNOS基因表達(dá)升高。(5)同時(shí)westernblot結(jié)果表明PPTA能降低iNOS蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)論:目前的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明PPTA能夠改善腦缺血損傷帶來的記憶缺失和海馬