梓醇對(duì)大鼠腦缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、缺血/再灌注是機(jī)體或某個(gè)器官血供中斷或不足，隨后組織器官灌流恢復(fù)再充氧而造成的一種病理狀態(tài)。較常見的就是動(dòng)脈血流被栓塞物阻塞，導(dǎo)致嚴(yán)重的代謝物供給失調(diào)，最終導(dǎo)致組織缺氧壞死。恢復(fù)血流和氧氣供給后，組織損傷會(huì)加重，并且伴隨產(chǎn)生較為嚴(yán)重的病理反應(yīng)，稱為再灌注損傷。當(dāng)腦組織缺血缺氧后再次恢復(fù)血供的過(guò)程中，微環(huán)境中會(huì)產(chǎn)生大量損傷性因子如氧自由基等，對(duì)線粒體功能產(chǎn)生影響。該過(guò)程不僅對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物膜產(chǎn)生損傷，還會(huì)對(duì)細(xì)胞核內(nèi) DNA和組蛋白造成影響，誘

2、發(fā)細(xì)胞啟動(dòng)凋亡程序。由于神經(jīng)細(xì)胞具有不可再生性，所以腦缺血再灌損傷造成的后果極為嚴(yán)重。
　　目前對(duì)于缺血/再灌注損傷的治療手段主要有缺血預(yù)處理、代謝的策略增加缺血耐受、氣體治療、核苷酸和核苷信號(hào)治療以及通過(guò)MicroRNAs治療。但這些方法都存在一些缺陷和不足，在治療的效果方面也差強(qiáng)人意，因此尋找其他有效的治療方案或者治療藥物就顯得格外重要。
　　梓醇(Catalpol)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種糖苷，來(lái)源于中藥成分。1969年首

3、次分離提純，它能透過(guò)血腦屏障進(jìn)入血液循環(huán)發(fā)揮多種生物學(xué)作用如抑制炎性反應(yīng)、抑制腫瘤細(xì)胞、延遲衰老以及護(hù)肝養(yǎng)肝等多種藥理作用。本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)大腦中動(dòng)脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）的方法來(lái)模擬缺血狀態(tài)，制作大鼠局灶性腦缺血模型，探究梓醇對(duì)大鼠腦組織局部缺血后恢復(fù)血供所造成損傷后的保護(hù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)一、梓醇對(duì)大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的治療作用
　　目的：探討梓醇對(duì)大鼠局灶

4、性腦缺血/再灌注損傷的治療作用。
　　方法：雄性 SD大鼠（280-320 g）24只，隨機(jī)分為4組（n=6）：①M(fèi)CAO組：MCAO模型（缺血120min）；②溶劑對(duì)照組（Vehicle組）：缺血120min/再灌注后腹腔注射0.1mol/l的DMSO；③梓醇1mg/kg組（Catalpol-1組）：缺血120min/再灌注后腹腔注射1mg/kg的梓醇；④梓醇5mg/kg組（Catalpol-5組）：缺血120min/再灌注后腹

5、腔注射5mg/kg的梓醇。再灌注48h后，對(duì)四組大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為缺陷評(píng)分NDS和TTC染色。
　　結(jié)果：缺血再灌48h，與MCAO組相比Catalpol1mg/kg和Catalpol5mg/kg組大鼠的神經(jīng)功能缺陷評(píng)分明顯較低（P<0.05）。與MCAO組相比 Catalpol1mg/kg和Catalpol5mg/kg組大鼠損傷后48 h腦梗死容積百分比顯著下降。
　　結(jié)論：梓醇能顯著減少大鼠大腦的缺血/再灌注損傷，對(duì)大鼠大

6、腦神經(jīng)系統(tǒng)功能具有很好的保護(hù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)二、梓醇對(duì)大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷后神經(jīng)元凋亡的影響
　　目的：探討梓醇對(duì)大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷后神經(jīng)元凋亡的影響。
　　方法：另取雄性SD大鼠（280-320 g）24只，隨機(jī)分為4組（n=6）：假手術(shù)組（Sham組）；MCAO組；溶劑對(duì)照組（Vehicle組）；梓醇組（Catalpol組）。Sham組動(dòng)物單純進(jìn)行手術(shù)操作，不進(jìn)行 MCAO模型構(gòu)建；MCAO組、V

7、ehicle組、Catalpol組大鼠進(jìn)行MCAO模型構(gòu)建處理，建立方法同實(shí)驗(yàn)一，再灌注48h后，運(yùn)用TUNEL免疫熒光染色檢測(cè)各組大鼠神經(jīng)元的凋亡，用Western blot檢測(cè)對(duì)凋亡蛋白的影響。結(jié)果：TUNEL染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Sham組幾乎無(wú)染色陽(yáng)性細(xì)胞，其余三組凋亡明顯；MCAO組TUNEL染色陽(yáng)性明顯多于Catalpol組（P<0.05），表明梓醇處理組神經(jīng)元的凋亡數(shù)量明顯較少。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，

8、I/R后48h Cataipol組和MCAO組 Bcl-2表達(dá)明顯減少，Bax和Cleaved caspase-3表達(dá)明顯增高（P<0.05）；但與MCAO組相比，Cataipol組Bcl-2水平明顯較高，Bax和Cleaved caspase-3水平明顯較少（P＜0.05）。
　　結(jié)論：梓醇通過(guò)抑制大鼠腦缺血再灌后神經(jīng)元的凋亡，起到大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)三、梓醇對(duì)大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷后氧

9、化應(yīng)激水平的影響
　　目的：探討梓醇對(duì)大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷后抗氧化物酶、GSH-PX和MDA水平的影響。
　　方法：另取雄性SD大鼠（280-320 g）24只，隨機(jī)分為4組（n=6）：假手術(shù)組（Sham組）；MCAO組；溶劑對(duì)照組（Vehicle組）；梓醇組（Catalpol組）。Sham組動(dòng)物單純進(jìn)行手術(shù)操作，不進(jìn)行MCAO模型構(gòu)建；MCAO組、Vehicle組、Catalpol組大鼠進(jìn)行MCAO模型構(gòu)建處理，建

10、立方法同實(shí)驗(yàn)一，并于再灌注后48 h，用Elisa檢測(cè)腦組織SOD、Catalase、GSH-PX和MDA水平。
　　結(jié)果：再灌注后48h，與MCAO組相比 Catalpol組大鼠I/R后腦組織內(nèi)GSH-PX活性明顯較高（P<0.05），I/R后腦組織內(nèi)MDA含量明顯較低（P<0.05），血漿中Catalpol組SOD活性及Catalase活性均明顯增強(qiáng)（P<0.05）。且再灌注48h后MCAO組GSH-PX、SOD及Catala

11、se活性明顯低于Sham組（P<0.05）。
　　結(jié)論：梓醇具有清除自由基的神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過(guò)增加GSH-PX活性和降低MDA水平來(lái)治療大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷。
　　實(shí)驗(yàn)四、NADPH氧化酶與梓醇腦保護(hù)機(jī)制關(guān)系研究
　　目的：探討梓醇腦保護(hù)機(jī)制及NADPH氧化酶的關(guān)系
　　方法：取雄性SD大鼠（280-320 g）24只，隨機(jī)分為4組（n=6）：假手術(shù)組（Sham組）；MCAO組；溶劑對(duì)照組（Ve

12、hicle組）；梓醇組（Catalpol組）。Sham組動(dòng)物單純進(jìn)行手術(shù)操作，不進(jìn)行 MCAO模型構(gòu)建；MCAO組、Vehicle組、Catalpol組大鼠進(jìn)行MCAO模型構(gòu)建處理，建立方法同實(shí)驗(yàn)一，再灌注48h后，運(yùn)用Western blot檢測(cè)對(duì)NOX2含量的影響。
　　另取雄性SD大鼠（280-320 g）36只，隨機(jī)分為6組（n=6）：①M(fèi)CAO組：MCAO模型（缺血120min）；②溶劑對(duì)照組（vehicle組）：MCA

13、O前腹腔注射PBS2μL；③DMSO組：MCAO前腹腔注射0.1mol/l的DMSO；④TBCA組：MCAO前60min腹腔注射TBCA（20nmol in2μL of50％（v/v）DMSO in PBS），NADPH氧化酶的激動(dòng)劑；⑤梓醇5mg/kg組（Catalpol組）：MCAO前30min腹腔注射5mg/kg的梓醇；⑥梓醇+TBCA組（Catalpol+TBCA組）：MCAO前60min腹腔注射TBCA（20nmol in2μ

14、L），MCAO前30min腹腔注射Catalpol5mg/kg。進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，腦梗死溶劑測(cè)定，血漿及腦組織內(nèi)抗氧化物酶活性及MDA含量測(cè)定。
　　結(jié)果：Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，再灌注48h后，與Sham組相比，Cataipol組和MCAO組NOX2蛋白表達(dá)明顯增高（P<0.05)，Cataipol組增高程度較MCAO組少（P<0.05）。
　　再灌注48 h后大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分Catalpol顯著低于MCA

15、O組（P<0.05），而Catalpol+TBCA組顯著高于Catalpol組（P<0.05）。再灌注48 h后大鼠腦梗死容積在Catalpol組顯著低于MCAO組（P<0.05），而Catalpol+TBCA組顯著高于Catalpol組（P<0.05）。與MCAO組相比，血漿中或是腦組織中，梓醇可增加SOD和Catalase的活性，以及MDA的含量；而與Catalpol組相比，TBCA+Catalpol組則 SOD活性、Catalas

16、e活性顯著減少，并且伴隨著MDA含量的增加。
　　結(jié)論：梓醇對(duì)腦組織保護(hù)作用機(jī)制為增加抗氧化物酶 SOD和Catalase的活性，同時(shí)減少M(fèi)DA的含量，增加機(jī)體的抗氧化能力。并通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3水平影響細(xì)胞凋亡。NOX2激動(dòng)劑TBCA可逆轉(zhuǎn)梓醇的腦保護(hù)作用，因此推測(cè)梓醇保護(hù)腦缺血/再灌注后神經(jīng)系統(tǒng)的機(jī)制與抑制NOX2的生物學(xué)作用有關(guān)。
　　小結(jié)：
　　梓醇可減少大鼠局灶