梓醇對大鼠腦缺血-再灌注損傷的保護作用及其機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、缺血/再灌注是機體或某個器官血供中斷或不足,隨后組織器官灌流恢復(fù)再充氧而造成的一種病理狀態(tài)。較常見的就是動脈血流被栓塞物阻塞,導(dǎo)致嚴重的代謝物供給失調(diào),最終導(dǎo)致組織缺氧壞死?;謴?fù)血流和氧氣供給后,組織損傷會加重,并且伴隨產(chǎn)生較為嚴重的病理反應(yīng),稱為再灌注損傷。當(dāng)腦組織缺血缺氧后再次恢復(fù)血供的過程中,微環(huán)境中會產(chǎn)生大量損傷性因子如氧自由基等,對線粒體功能產(chǎn)生影響。該過程不僅對細胞內(nèi)生物膜產(chǎn)生損傷,還會對細胞核內(nèi) DNA和組蛋白造成影響,誘

2、發(fā)細胞啟動凋亡程序。由于神經(jīng)細胞具有不可再生性,所以腦缺血再灌損傷造成的后果極為嚴重。
  目前對于缺血/再灌注損傷的治療手段主要有缺血預(yù)處理、代謝的策略增加缺血耐受、氣體治療、核苷酸和核苷信號治療以及通過MicroRNAs治療。但這些方法都存在一些缺陷和不足,在治療的效果方面也差強人意,因此尋找其他有效的治療方案或者治療藥物就顯得格外重要。
  梓醇(Catalpol)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種糖苷,來源于中藥成分。1969年首

3、次分離提純,它能透過血腦屏障進入血液循環(huán)發(fā)揮多種生物學(xué)作用如抑制炎性反應(yīng)、抑制腫瘤細胞、延遲衰老以及護肝養(yǎng)肝等多種藥理作用。本實驗采用傳統(tǒng)大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)的方法來模擬缺血狀態(tài),制作大鼠局灶性腦缺血模型,探究梓醇對大鼠腦組織局部缺血后恢復(fù)血供所造成損傷后的保護作用。
  實驗一、梓醇對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的治療作用
  目的:探討梓醇對大鼠局灶

4、性腦缺血/再灌注損傷的治療作用。
  方法:雄性 SD大鼠(280-320 g)24只,隨機分為4組(n=6):①MCAO組:MCAO模型(缺血120min);②溶劑對照組(Vehicle組):缺血120min/再灌注后腹腔注射0.1mol/l的DMSO;③梓醇1mg/kg組(Catalpol-1組):缺血120min/再灌注后腹腔注射1mg/kg的梓醇;④梓醇5mg/kg組(Catalpol-5組):缺血120min/再灌注后腹

5、腔注射5mg/kg的梓醇。再灌注48h后,對四組大鼠進行神經(jīng)行為缺陷評分NDS和TTC染色。
  結(jié)果:缺血再灌48h,與MCAO組相比Catalpol1mg/kg和Catalpol5mg/kg組大鼠的神經(jīng)功能缺陷評分明顯較低(P<0.05)。與MCAO組相比 Catalpol1mg/kg和Catalpol5mg/kg組大鼠損傷后48 h腦梗死容積百分比顯著下降。
  結(jié)論:梓醇能顯著減少大鼠大腦的缺血/再灌注損傷,對大鼠大

6、腦神經(jīng)系統(tǒng)功能具有很好的保護作用。
  實驗二、梓醇對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷后神經(jīng)元凋亡的影響
  目的:探討梓醇對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷后神經(jīng)元凋亡的影響。
  方法:另取雄性SD大鼠(280-320 g)24只,隨機分為4組(n=6):假手術(shù)組(Sham組);MCAO組;溶劑對照組(Vehicle組);梓醇組(Catalpol組)。Sham組動物單純進行手術(shù)操作,不進行 MCAO模型構(gòu)建;MCAO組、V

7、ehicle組、Catalpol組大鼠進行MCAO模型構(gòu)建處理,建立方法同實驗一,再灌注48h后,運用TUNEL免疫熒光染色檢測各組大鼠神經(jīng)元的凋亡,用Western blot檢測對凋亡蛋白的影響。結(jié)果:TUNEL染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),Sham組幾乎無染色陽性細胞,其余三組凋亡明顯;MCAO組TUNEL染色陽性明顯多于Catalpol組(P<0.05),表明梓醇處理組神經(jīng)元的凋亡數(shù)量明顯較少。Western blot檢測發(fā)現(xiàn),與Sham組相比,

8、I/R后48h Cataipol組和MCAO組 Bcl-2表達明顯減少,Bax和Cleaved caspase-3表達明顯增高(P<0.05);但與MCAO組相比,Cataipol組Bcl-2水平明顯較高,Bax和Cleaved caspase-3水平明顯較少(P<0.05)。
  結(jié)論:梓醇通過抑制大鼠腦缺血再灌后神經(jīng)元的凋亡,起到大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的保護作用。
  實驗三、梓醇對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷后氧

9、化應(yīng)激水平的影響
  目的:探討梓醇對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷后抗氧化物酶、GSH-PX和MDA水平的影響。
  方法:另取雄性SD大鼠(280-320 g)24只,隨機分為4組(n=6):假手術(shù)組(Sham組);MCAO組;溶劑對照組(Vehicle組);梓醇組(Catalpol組)。Sham組動物單純進行手術(shù)操作,不進行MCAO模型構(gòu)建;MCAO組、Vehicle組、Catalpol組大鼠進行MCAO模型構(gòu)建處理,建

10、立方法同實驗一,并于再灌注后48 h,用Elisa檢測腦組織SOD、Catalase、GSH-PX和MDA水平。
  結(jié)果:再灌注后48h,與MCAO組相比 Catalpol組大鼠I/R后腦組織內(nèi)GSH-PX活性明顯較高(P<0.05),I/R后腦組織內(nèi)MDA含量明顯較低(P<0.05),血漿中Catalpol組SOD活性及Catalase活性均明顯增強(P<0.05)。且再灌注48h后MCAO組GSH-PX、SOD及Catala

11、se活性明顯低于Sham組(P<0.05)。
  結(jié)論:梓醇具有清除自由基的神經(jīng)保護作用,其機制可能通過增加GSH-PX活性和降低MDA水平來治療大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷。
  實驗四、NADPH氧化酶與梓醇腦保護機制關(guān)系研究
  目的:探討梓醇腦保護機制及NADPH氧化酶的關(guān)系
  方法:取雄性SD大鼠(280-320 g)24只,隨機分為4組(n=6):假手術(shù)組(Sham組);MCAO組;溶劑對照組(Ve

12、hicle組);梓醇組(Catalpol組)。Sham組動物單純進行手術(shù)操作,不進行 MCAO模型構(gòu)建;MCAO組、Vehicle組、Catalpol組大鼠進行MCAO模型構(gòu)建處理,建立方法同實驗一,再灌注48h后,運用Western blot檢測對NOX2含量的影響。
  另取雄性SD大鼠(280-320 g)36只,隨機分為6組(n=6):①MCAO組:MCAO模型(缺血120min);②溶劑對照組(vehicle組):MCA

13、O前腹腔注射PBS2μL;③DMSO組:MCAO前腹腔注射0.1mol/l的DMSO;④TBCA組:MCAO前60min腹腔注射TBCA(20nmol in2μL of50%(v/v)DMSO in PBS),NADPH氧化酶的激動劑;⑤梓醇5mg/kg組(Catalpol組):MCAO前30min腹腔注射5mg/kg的梓醇;⑥梓醇+TBCA組(Catalpol+TBCA組):MCAO前60min腹腔注射TBCA(20nmol in2μ

14、L),MCAO前30min腹腔注射Catalpol5mg/kg。進行神經(jīng)行為學(xué)評分,腦梗死溶劑測定,血漿及腦組織內(nèi)抗氧化物酶活性及MDA含量測定。
  結(jié)果:Western blot檢測發(fā)現(xiàn),再灌注48h后,與Sham組相比,Cataipol組和MCAO組NOX2蛋白表達明顯增高(P<0.05),Cataipol組增高程度較MCAO組少(P<0.05)。
  再灌注48 h后大鼠神經(jīng)功能缺陷評分Catalpol顯著低于MCA

15、O組(P<0.05),而Catalpol+TBCA組顯著高于Catalpol組(P<0.05)。再灌注48 h后大鼠腦梗死容積在Catalpol組顯著低于MCAO組(P<0.05),而Catalpol+TBCA組顯著高于Catalpol組(P<0.05)。與MCAO組相比,血漿中或是腦組織中,梓醇可增加SOD和Catalase的活性,以及MDA的含量;而與Catalpol組相比,TBCA+Catalpol組則 SOD活性、Catalas

16、e活性顯著減少,并且伴隨著MDA含量的增加。
  結(jié)論:梓醇對腦組織保護作用機制為增加抗氧化物酶 SOD和Catalase的活性,同時減少MDA的含量,增加機體的抗氧化能力。并通過影響細胞內(nèi)Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3水平影響細胞凋亡。NOX2激動劑TBCA可逆轉(zhuǎn)梓醇的腦保護作用,因此推測梓醇保護腦缺血/再灌注后神經(jīng)系統(tǒng)的機制與抑制NOX2的生物學(xué)作用有關(guān)。
  小結(jié):
  梓醇可減少大鼠局灶

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