TopBP1蛋白在細(xì)胞DNA損傷中的作用機(jī)制.pdf

1、為了保證細(xì)胞損傷后基因組的完整性，細(xì)胞通常會(huì)啟動(dòng)檢測(cè)點(diǎn)機(jī)制以阻止細(xì)胞周期的進(jìn)展。其中兩個(gè)PIKK激酶(phosphinositide 3-kinase-like kinase，磷酸肌醇3激酶樣激酶)起著中心的作用：ATM(ataxia telan-giectasia mutated，共濟(jì)失調(diào)及毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變蛋白)與ATR(ATMand Rad3 related，ATM與Rad3相關(guān)蛋白)。ATM被認(rèn)為負(fù)責(zé)放射損傷導(dǎo)致的檢查點(diǎn)阻滯的激

2、酶，而ATR則被認(rèn)為負(fù)責(zé)復(fù)制受阻所致的基因組損傷。二者之間有互補(bǔ)性及簡(jiǎn)并的功能。在ATR信號(hào)傳導(dǎo)途徑，ATR會(huì)激活并使許多下游的底物磷酸化，其中最主要的是Chkl激酶(Cheekpointkinase protein 1，檢測(cè)點(diǎn)激酶蛋白1)。Chkl一旦被激活會(huì)進(jìn)一步作用于下游底物，其中主要為Cde25A。而Cdc25A會(huì)進(jìn)一步調(diào)控Cdk與Cyelin復(fù)合物。迄今為止ATR-Chkl信號(hào)傳導(dǎo)途徑已是被公認(rèn)的應(yīng)答途徑。 檢查點(diǎn)蛋白

3、通常被分類成如下幾類：探測(cè)蛋白，介導(dǎo)蛋白，近端信號(hào)傳導(dǎo)激酶，遠(yuǎn)端信號(hào)傳導(dǎo)激酶，效應(yīng)蛋白。其中介導(dǎo)蛋白被認(rèn)為提供場(chǎng)所或者在上游激酶或下游激酶進(jìn)行信號(hào)傳遞的一組蛋白。由于對(duì)損傷應(yīng)答的不同，ATM與ATR的介導(dǎo)蛋白不同，其中Mdcl，53BPl(p53 binding pro-tein 1，p53結(jié)合蛋白1)與BRCAl主要聯(lián)系于ATM，而Claspin(目前無(wú)對(duì)應(yīng)中文翻譯)與TopBPl(TopoisomeraseⅡβ binding pr

4、otein 1，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱβ結(jié)合蛋白1)則被認(rèn)為是ATR信號(hào)傳導(dǎo)途徑的介導(dǎo)蛋白。 TopBPl．是含有8個(gè)BRCT功能域(BRCAl C-terminus，BRCAl C端)1522個(gè)氨基酸的蛋白。首先被認(rèn)為是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱβ結(jié)合蛋白，在裂殖酵母及芽殖酵母中分別對(duì)應(yīng)為Rad4與Cut5，在細(xì)胞受到輻射后形成IRIF(Ionizing radiation induced loci，放射損傷導(dǎo)致的損傷灶)，此功能也依賴于其第5

5、個(gè)BRCT、功能域。此外，除了DNA損傷時(shí)信號(hào)的傳導(dǎo)，TopBPl還有其他的功能，是DNA復(fù)制啟動(dòng)所必需的及當(dāng)復(fù)制受阻時(shí)維持復(fù)制叉的完整性，DNA的修復(fù)，可以抑制E2F1．介導(dǎo)的凋亡及調(diào)節(jié)正常的S期細(xì)胞周期等等。Claspin是Chkl的結(jié)合蛋白。在人類及非洲爪蟾的基因序列非常保守，當(dāng)細(xì)胞受到外界損傷后而這兩種蛋白質(zhì)形成一個(gè)穩(wěn)定的復(fù)合物。在酵母這個(gè)復(fù)合物的形成依賴于人類ATR的類似物Mecl，進(jìn)一步詳盡的研究表明，Claspin直接結(jié)

6、合在Chkl的激酶區(qū)。Claspin也同樣地與ATR直接結(jié)合，這樣就形成了一個(gè)模型：Claspin將Chkl集中到ATR周圍，而已經(jīng)磷酸化的Chkl則會(huì)擴(kuò)散到整個(gè)細(xì)胞核，發(fā)揮其功能作用。 然而到目前為止，TopBPl與Claspin如何同時(shí)作用于Chkl的磷酸化，以致于導(dǎo)致其激活，及這兩種蛋白對(duì)ATR其他底物的作用，尚不清楚。本研究的目的是試圖研究這兩種蛋白在細(xì)胞受到損傷的作用是如何調(diào)節(jié)Chkl的活性的。同時(shí)通過克隆不同的T

7、opBPl變異蛋白，試圖研究TopBPI的BRCT功能域，及TopBPl蛋白在癌癥發(fā)生中的作用。 材料與方法 1．質(zhì)粒與克隆 (1)PCNA-Venus：PCR擴(kuò)增編碼YFP-Venus的eDNA(由iapa-ner提供)然后將其克隆至pEGFP-C1(Clontech)中，并替代EGFP。然后再PCR擴(kuò)增編碼PCNA的cDNA，將其按框架插入YFP-Venus之后。 (2)FLAG-tagged

8、 Chkl野生型及激酶滅活型，雙突變(serine317and 345被突變成alanine)(Chkl-2A)被克隆至pCI-Neo(由Sorensen提供)。 (3)shRNA-TopBPl-pSUPERIOR及shRNA-Claspin-pSUPE-RIOR：將分別針對(duì)TopBPI及Claspin的oligoes克隆至pSUPERIOR(OligoEngine)的BgllI/HindlII位點(diǎn)。針對(duì)TopBPl的oligo

9、為(5’-CCTGAAGAAACCTATTTTG-3’)，針對(duì)Claspin的oligo(5’-GCAATGAAACTCCGAAGGT-3’)。 2．抗體與siRNAs 兔多克隆抗體P-Chkl$317，P-Chkl$345，P-Nbsl$343，P-Smcl S966(從Cell Signaling購(gòu)買)，TopBPI(Abcam)，Claspin(Bethyland Abcam)，Chkl(Santa Cruz)

10、and 53BPl(Santa Cruz)，山羊多克隆抗體Mcm6(Santa Cruz)．鼠單克隆抗體γ-H2AX(Upstate)，F(xiàn)LAG(clone M2，Sigma)，Chkl(DCS-316)，Cdk7(MO-7)，Mcm7(DCS-141)and the p32 subunit of RPA(Neomarkers)and大鼠單克隆抗體Br—dU(OBT0030CX—Immunologicals Direct)。 s

11、iRNA對(duì)TopBPl為AGACCUUAAUGUAUCAGUAdTdT siRNA對(duì)Claspin為GCACAUACAUGAUAAAGAA均從(Drama—con購(gòu)買) 對(duì)照siRNA為針對(duì)HSP70B的序列，在U2OS細(xì)胞中這種基因缺失。 3．細(xì)胞培養(yǎng)與損傷處理 1)人成骨肉瘤U20S細(xì)胞(Danish Cancer Society)在含有10％小牛血清及青鏈霉素的Dulbeccos Modifi

12、ed Eagle Medium(DMEM，Invitro—gen)培養(yǎng)。對(duì)于活細(xì)胞成像，細(xì)胞用不含C0<,2>的培養(yǎng)液(Invitrogen)并且用Lab--Tek microscope glass chambers(Nalge Nunc International)。 2)siRNAs的轉(zhuǎn)染用oligofectamin(Invitrogen)，質(zhì)粒的穩(wěn)定及短暫轉(zhuǎn)染用FuGene 6(Roche Diagnostics GmbH

13、)，操作方法按照使用手冊(cè)。 A)Claspin及TopBPl inducible shRNA穩(wěn)定細(xì)胞系的建立：將shR—NA—TopBPl一pSUPERIOR或shRNA—Claspin—pSUPERIOR與PCDNA6 T/O(含有Tet--repressor)同時(shí)轉(zhuǎn)染到U20S細(xì)胞中，24小時(shí)后用puromycin(Sigma—lμg/ml)與blasticidin(InvivoGen一5μg/ml)篩選。兩周后挑選單個(gè)克隆

14、，擴(kuò)增后，免疫印跡法驗(yàn)證。用終濃度為2μg/ml doxycyclin(BD Biosciences)誘導(dǎo)shRNA的表達(dá)。 B)穩(wěn)定表達(dá)GFP--ATR的U20S細(xì)胞系(Jazayeri提供)。 C)細(xì)胞的放射損傷用X—Ray generator(Pantak HF160，150kV。15mA dose rate 2.18 Gy/min)。UV損傷用Stratalinker 1800(Strata—gene)。

15、 D)Hu(Sigma)加人使終濃度為2mM。 E)激光微照射(Laser micro--irradiation)：先將細(xì)胞培養(yǎng)于含有10μM BrdU 24小時(shí)，然后至于不含CO<,2>的培養(yǎng)液中，用337 nm UV—A laser照射大約200個(gè)細(xì)胞。 4．免疫化學(xué)技術(shù) 細(xì)胞用含有20 mM Tris，150mM NaCl，1mM EDTA與0.5％NP--40并加入抑制劑的溶液裂解。 免

16、疫沉淀法，首先將1—1.5mg裂解物用40μ150％的Gsepharoseslurry預(yù)先混合30分鐘，然后加入2ug的FLAG單克隆抗體，混合-小時(shí)；再離心去上清，用IP緩沖液洗4遍，用免疫印跡法分析免疫沉淀物。對(duì)于Chkl的印跡，我們用HRP—coupled Protein A來代替常規(guī)的第二抗體，以去除Chkl與IgG的重鏈區(qū)重疊的影響。 免疫熒光，將細(xì)胞培養(yǎng)在玻片上(Menzel)，用4％paraformaldehyde

17、室溫下固定15分鐘，然后用0.2％Triton X-100滲透化5分鐘。用指定的第一抗體染色-小時(shí)，用coupled tO Alexa dyes with excitation wave-lengths of 488，568或647 nm的第二抗體染色30分鐘(MolecularProbes)．在有特殊標(biāo)記的部位用ToPrO3(Molecular Probes)復(fù)染，其他的用DAPI-containing mounting medium

18、復(fù)染(Vectashield)．圖像的取得用帶有PLAN-Neofluar 40x/1.3 oil immersion 04ective(Carl Zeiss)的LSM510共聚焦掃描顯微鏡(Carl Zeiss)。 免疫印跡：取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞用含有酶抑制劑的IP緩沖液裂解，Bradford方法進(jìn)行蛋白定量，之后與4*LSB緩沖液混合后100℃加熱5分鐘，加樣于6％-15％SDS-PAGE 100V電泳2小時(shí)，半干式轉(zhuǎn)印2小時(shí)

19、。然后先后孵育第一抗體及第二抗體(結(jié)合辣根過氧化物酶的馬抗鼠或兔IgG，Vector laboratories)，之后ECL顯色(SuperSignalWest Pico(Dura，F(xiàn)emto)Luminol Enhancer Solution與SuperSignalWest Pico(Dura，F(xiàn)em—to)Stable Peroxide Solution，PIERCE)與曝光。 5．流式細(xì)胞術(shù) 對(duì)指定時(shí)間的細(xì)胞消化后

20、用70％甲醇固定，之后用0.25％Triton X-100滲透化，之后用含有RNA酶的PI(0.1 mg/ml in PBS)37度染色10分鐘，用FACSCalibur flow cytometer(BD Biosciences)的CellQuestsoftware分析結(jié)果。 1．(1)RNA干擾使蛋白下調(diào)的模型的建立。我們成功地克隆了分別誘導(dǎo)下調(diào)TopBPl與Claspin的細(xì)胞系，經(jīng)過免疫印跡檢測(cè)TopBPlClaspin

21、的下調(diào)分別在Doxycyclin誘導(dǎo)后72小時(shí)及24小時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)。而且通過流式細(xì)胞術(shù)的分析，在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，兩種蛋白的下調(diào)并不干擾細(xì)胞周期的變化(圖1A及圖S1)。 (2)TopBPl或Claspin的下調(diào)使DNA損傷導(dǎo)致的Chkl激酶的磷酸化顯著受阻。給予這兩種細(xì)胞系予以UV-C(254nm，10J/m<'2>),照射損傷。因?yàn)閁V-C使ATR-Chkl信號(hào)途徑激活。在兩個(gè)細(xì)胞系中，當(dāng)兩種蛋白質(zhì)下調(diào)后，我們均觀察到了Ch

22、kl磷酸化信號(hào)的強(qiáng)烈衰減，而且我們觀察到TopBPl的下調(diào)導(dǎo)致更加明顯的效果(圖1B，C)。 (3)TopBPl與Claspin對(duì)DNA損傷導(dǎo)致的ATR介導(dǎo)的下游底物磷酸化的影響。在UV與Hu導(dǎo)致的DNA損傷中，在TopBPl下調(diào)的細(xì)胞，所有的ATR底物磷酸化均受阻，而在Claspin下調(diào)的細(xì)胞，僅Chkl磷酸化受阻(圖2A)。另外，在IR介導(dǎo)的DNA損傷中，在兩種蛋白分別下調(diào)的細(xì)胞中，僅Chkl的磷酸化受阻。進(jìn)一步在進(jìn)行兩種蛋白

23、雙重下調(diào)的實(shí)驗(yàn)中，Chkl的磷酸化下調(diào)水平并不是隨著Claspin的下調(diào)而進(jìn)一步下降(圖2B及圖S2)。 (4)TopBPl與Claspin的空間分布特點(diǎn)。在DNA損傷后，TopBPl與ATR緊密地在損傷處形成小的foci(圖3B)；而Claspin則是同Chkl類似，迅速地?cái)U(kuò)展到全細(xì)胞核，并不在損傷處聚集(圖3A)。又及TopBPl的下調(diào)對(duì)ATR在損傷處的聚集無(wú)影響(圖3D)。 (5)Claspin而不是TopBP

24、l的下調(diào)導(dǎo)致了與Chkl受抑類似的表現(xiàn)型，即在Claspin下調(diào)后，H2AX的磷酸化在S期細(xì)胞升高，而在TopBPI的下調(diào)的細(xì)胞則無(wú)類似的發(fā)現(xiàn)(圖4A，B)。 (6)TopBPl而不是Claspin是對(duì)復(fù)制受阻導(dǎo)致的H2AX磷酸化的主要因素。給予下調(diào)TopBPl的細(xì)胞UV照射，并用免疫印跡法研究磷酸化的H2AX的表達(dá)。與對(duì)照細(xì)胞相比，H2AX的磷酸化在TopBPl下調(diào)的細(xì)胞顯著受阻(圖5A)。 (7)在DNA損傷Cla

25、spin與Chkl的結(jié)合依賴于TopBPl。首先通過短暫轉(zhuǎn)染Flag標(biāo)記的Chkl到U2OS細(xì)胞中，證實(shí)了Claspin與Chkl僅僅在UV損傷后結(jié)合，在給予ATR的抑制劑咖啡因后，特別地抑制了這種結(jié)合(圖6A)。另外，我們還發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)重要的Chkl磷酸化位點(diǎn)s317與s345對(duì)二者之間的結(jié)合并無(wú)影響。在幾次實(shí)驗(yàn)中，均發(fā)現(xiàn)了激酶滅活型的Chkl在與Claspin結(jié)合的有不同程度的減低?；蛘咴诮o予UCN-O1的處理后也有類似的發(fā)現(xiàn)(圖6B

26、)。為了證實(shí)這是否依賴于TopBPl，給予誘導(dǎo)下調(diào)TopBPl的細(xì)胞轉(zhuǎn)染以Flag-Chkl，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后給予UV 25J/m<'2>。免疫印跡結(jié)果顯示在TopBPl下調(diào)的細(xì)胞中Claspin與Chkl的結(jié)合顯著降低(圖6C)。這些結(jié)果表明，TopBPl不僅直接作用于Chkl的s317與s345的磷酸化，也對(duì)Claspin與Chkl的結(jié)合起著重要的作用。 2．克隆了兩個(gè)新的質(zhì)粒：AcGFP-C1-TopBPl(shRNA-in

27、sensi-tive)及AcGFP-C1-TopBPl(shRNA-insensitive and R309C)。 3．克隆了FLAG，標(biāo)記的含有完整TopBPl cDNA及包含不同BRCT、功能域的TopBPl片段及上述質(zhì)粒的W1145R，DDll46(7)AA，EEll52 (3)AA的突變序列。 檢測(cè)點(diǎn)是維持基因組完整性非常重要的機(jī)制之一，ATR—Chkl信號(hào)傳導(dǎo)通路在細(xì)胞受到UV或Hu損傷所致的復(fù)制叉受阻

28、所發(fā)生的細(xì)胞信號(hào)活動(dòng)起著至關(guān)重要的作用。 有報(bào)告表明，ATR對(duì)Chkl的激酶活化需要Claspin的參與，在裂殖酵母中Rad4<'TOpBP1>是Rad3<'ATR>的調(diào)控蛋白。根據(jù)這些資料，我們提出一些問題，1．在人類細(xì)胞中TopBPl是否為ATR的調(diào)控蛋白。2．如果TopBPI與Claspin都是激活Chkl所必需的，那么二者之間的關(guān)系是如何的。3．Claspin蛋白對(duì)ATR的其他底物磷酸化是怎樣的?4．TopBPl是否對(duì)A

29、TR在損傷處的聚集有影響?我們通過一系列實(shí)驗(yàn)逐一驗(yàn)證并試圖回答了這些問題，并且首次提出了一個(gè)TopBPl與Claspin如何監(jiān)控ATR—Chkl維持基因組完整性的模型，在這個(gè)模型中，TopBPl調(diào)節(jié)幾乎所有的ATR對(duì)下游底物的激活，而Claspin則專一性地將ATR與Chkl聯(lián)系在一起。這個(gè)模型與最近發(fā)表的TopBPl對(duì)ATR介導(dǎo)的Radl與Husl磷酸化是必需的一致。進(jìn)一步地證實(shí)了TopBPl作用于Claspin介導(dǎo)Chkl磷酸化的上

30、游。因?yàn)槲覀冞€發(fā)現(xiàn)Chkl磷酸化受阻在TopBPl下調(diào)的細(xì)胞較Claspin下調(diào)的細(xì)胞更加明顯。另外在TopBPl下調(diào)細(xì)胞中Chkl的活性受抑已達(dá)到最大化，而且進(jìn)一步下調(diào)Claspin對(duì)其已不再起作用。更進(jìn)一步證實(shí)了TopBPl對(duì)損傷后形成的Claspin-Chkl復(fù)合物是必需的。Dunphy等人在剛剛發(fā)表的報(bào)告中指出了在體外與體內(nèi)TopBPl均與ATR相結(jié)合以及TopBPl是ATR的全激動(dòng)劑。我們的報(bào)告也支持了這個(gè)結(jié)論。

31、 Chkl與ATR的其他底物顯著不同，這是由于Chkl激酶有著極為重要的功能，Chkl的敲除會(huì)導(dǎo)至胚胎死亡，Chkl的下調(diào)或其激酶活性受到抑制會(huì)使細(xì)胞在G2M期阻滯。因此這兩種蛋白對(duì)Chk1激酶活性的雙重調(diào)節(jié)可以使其生理活性得到更為精確地發(fā)揮。 除此之外，我們還第一次證實(shí)了Claspin與Chk1一樣，在基因組受到損傷后呈現(xiàn)出全細(xì)胞核內(nèi)分布的特點(diǎn)。而TopBP1則和ATR一樣，在損傷處聚集。TopBP1的下調(diào)對(duì)ATR在損傷處的聚

32、集沒有影響。結(jié)合已發(fā)表的資料，我們有如下猜想：RPA與ATRIP負(fù)責(zé)ATR在損傷處的聚集而TopBP1則負(fù)責(zé)對(duì)ATR的激活，ATR將信號(hào)傳導(dǎo)至Claspin再到Chk1。然而就這個(gè)模型而言還有許多不清楚的地方。例如，RPA是不是TopBP1蛋白在損傷處聚集的決定因素，如果不是，那么是什么蛋白決定TopBP1在損傷處的聚集；我們的結(jié)論表明TopBP1可以促進(jìn)Claspin與Chk1的結(jié)合，已知ATR可以同Chk1結(jié)合，Claspin與AT

33、R在有無(wú)DNA損傷的情況下相結(jié)合，并且按照我們的上述結(jié)果，ATR與TopBP1呈現(xiàn)相對(duì)靜止，Claspin與Chk1呈現(xiàn)相對(duì)動(dòng)態(tài)的變化，它們?cè)谡５募?xì)胞是如何達(dá)到一個(gè)平衡，在細(xì)胞受損時(shí)怎樣，在損傷得到修復(fù)時(shí)又會(huì)發(fā)生怎樣的變化。又及這些蛋白都有磷酸化形態(tài)，特別是Chkl的s345與s317是非常重要的磷酸化位點(diǎn)，這些蛋白的磷酸化形態(tài)與正常蛋白之間是如何達(dá)到平衡的。 TopBPl是否是一個(gè)抑癌基因也是十分有趣的課題。目前僅有一份未發(fā)

34、表的報(bào)告，TopBP1的R309C突變?cè)诎┌Y病人中有較高的發(fā)生率，又及TopBP1與BRCA1在序列及功能上有很多相似性，而BRCAl是已知的抑癌基因，我們推測(cè)TopBP1也具有抑癌基因的特征。因此我們?cè)O(shè)計(jì)了簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TopBP1的R309C突變對(duì)其功能的影響。 BRCT、家族有很多蛋白質(zhì)組成，BRCT也是非常重要的功能域，TopBP1作為唯一的僅擁有BRCT功能域的蛋白是研究BRCT功能的很好的對(duì)象。我們想知道的是在Top

35、BP1蛋白上，不同的BRCT功能域作用是否相同，以及它們是否協(xié)同作用，以及在BRCT功能域之間的連接部分是否也有一定的功能等等。 總之，TopBP1作為ATR的調(diào)節(jié)蛋白，而TopBP1與Claspin作為不同層面起著調(diào)節(jié)ATR活性的作用，因此在ATR—Chk1調(diào)節(jié)通路起著極為重要的作用。其作用機(jī)理細(xì)節(jié)還需要進(jìn)一步的研究。 結(jié)論 1．TopBPl是ATR激酶的全激動(dòng)劑，而Claspin僅作用于ATR對(duì)Chkl的激活

36、。TopBP1對(duì)ATR在損傷處的聚集沒有影響。這一點(diǎn)與A－TRIP和RPA對(duì)ATR的影響是不同的。 2．TopBP1和Claspin對(duì)Chk1激酶有著雙重調(diào)節(jié)作用。 3．TopBP1能促進(jìn)DNA損傷后Claspin與Chkl的結(jié)合。 4．TopBP1與ATR是相對(duì)靜止性的蛋白，而Claspin與Chkl是相對(duì)動(dòng)態(tài)性的蛋白，說明了二者對(duì)Chkl的不同層面的調(diào)節(jié)作用。 5．克隆了兩個(gè)新的質(zhì)粒：AcGFP－C1