熱休克蛋白70在紫外線致DNA損傷修復(fù)中的作用.pdf

1、真核生物和原核生物在高溫、接觸毒物和其它各種應(yīng)激因素(如煙堿、一氧化碳、重金屬、電離輻射、缺血缺氧等)等有害因素作用時，生物體會迅速啟動高度程序化的熱休克反應(yīng)(heatshockresponse，HSR)，誘導(dǎo)合成一組高度保守的熱休克蛋白質(zhì)(heatshockproteins，Hsps)。Hsps是生物界(包括從細(xì)菌到人的生物)經(jīng)過長期進(jìn)化仍舊保留下來的、對體內(nèi)外不良因素起保護(hù)作用的一類蛋白質(zhì)。根據(jù)Hsps在SDS-PAGE上的結(jié)果，按

2、其分子量大小將Hsps分為如下幾個家族：大分子HSPs(≥100kD)，HSP90(81-99kD)，HSP70(65-80kD)，HSP60(55-64kD)，HSP40(35-54kD)，小分子HSPs(≤34kD)，其中最為主要和重要的是HSP70家族的Hsp70。 Hsp70正常時分布在細(xì)胞漿，而有害因素應(yīng)激時則分布在細(xì)胞核，且分布于染色體周圍，這個重要現(xiàn)象提示了Hsp70在DNA保護(hù)中的可能作用與意義。DNA修復(fù)是一個

3、重要的研究方向，而大多數(shù)研究均只從不同的DNA修復(fù)來研究它們的重要作用與機(jī)制，但很少同時考慮到DNA損傷，更少考慮到重要蛋白質(zhì)在DNA損傷與修復(fù)平衡中的作用。Hsp70是重要的分子伴侶，參與蛋白質(zhì)的合成、折疊、裝配和運(yùn)輸以及變性蛋白質(zhì)的清除等，無疑它也可能與DNA損傷和修復(fù)相關(guān)酶的合成和功能有關(guān)。 本研究通過構(gòu)建Hsp70表達(dá)升高和降低兩種細(xì)胞模型，用紫外線C作為DNA損傷劑，利用彗星實(shí)驗(yàn)、Western-blot技術(shù)、實(shí)時定量

4、RT-PCR等方法來觀察Hsp70表達(dá)不同水平細(xì)胞中的DNA損傷和修復(fù)情況，來探討Hsp70在DNA損傷和修復(fù)過程的可能作用。本研究共分三部分。 第一部分Hsp70過表達(dá)及Hsp70表達(dá)抑制細(xì)胞模型的建立 對于Hsp70過表達(dá)細(xì)胞模型的建立，我們采用pcDNA3.0/hsp70重組質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染并用G418篩選穩(wěn)定的Hsp70高表達(dá)細(xì)胞株(A549/hsp70)?？蛰d體質(zhì)粒pcDNA3.0轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為平行轉(zhuǎn)染對照(A5

5、49/pcDNA)。 對于Hsp70表達(dá)抑制細(xì)胞模型的建立我們用了槲皮素抑制Hsp70表達(dá)和RNA干擾技術(shù)兩種方法并進(jìn)行了比較。 第二部分Hsp70在紫外線致DNA損傷中的作用 為闡明紫外線照射不同Hsp70表達(dá)后A549細(xì)胞DNA損傷的情況，本研究應(yīng)用MTT試驗(yàn)、彗星試驗(yàn)(單細(xì)胞瓊脂糖凝膠電泳)，檢測了紫外線C(UVC)照射不同劑量(10、20、40和80J/m2)對A549、A549/quercetin和A5

6、49/hsp70細(xì)胞DNA損傷的Olive尾矩。 第三部分Hsp70在紫外線致主要核苷酸切除修復(fù)酶mRNA變化中的作用 為了進(jìn)一步探討Hsp70在DNA修復(fù)過程中的作用，利用實(shí)時定量RT-PCR技術(shù)檢測了UVC照射不同劑量(10、20、40和80J/m2)對A549、A549/quercetin和A549/hsp70細(xì)胞中核苷酸切除修復(fù)途徑上DNA修復(fù)酶XPA、XPC、XPB、XPF、XPG和ERCC1基因mRNA的表達(dá)

7、，同時觀察了Hsp70蛋白水平和DNA核苷酸切除修復(fù)酶mRNA表達(dá)的相關(guān)關(guān)系。 綜上所述，本研究結(jié)果表明： (1)確定了槲皮素抑制A549細(xì)胞Hsp70表達(dá)的最佳劑量，150μmol/L的槲皮素可以有效抑制A549細(xì)胞Hsp70表達(dá)；采用含hsp70基因cDNA重組質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染并經(jīng)篩選建立了穩(wěn)定的Hsp70過表達(dá)細(xì)胞株。 (2)初步篩選了RNAi抑制Hsp70的有效序列(5'-CTTATGAACCACTTTG

8、ATTTGC-3')。 (3)Hsp70可以減輕紫外線C中低劑量(≤40J/m2)引起的A549細(xì)胞DNA損傷。 (4)紫外線C照射Hsp70表達(dá)抑制和Hsp70過表達(dá)細(xì)胞后的核苷酸切除修復(fù)過程中的DNA修復(fù)基因mRNA表達(dá)變化為：XPA表達(dá)在紫外線照射40J/m2時，A549/hsp70組表達(dá)明顯降低而A549/quercetin組未見明顯降低；XPC表達(dá)在20J/m2和40J/m2時紫外線照射時，A549/hsp70

9、組明顯升高，而A549/quercetin組未見變化；XPB表達(dá)在紫外線照射的各劑量組，A549/quercetin組明顯升高，A549/hsp70組與A549組相比未見顯著性差異；XPF在紫外線照射的高劑量時，A549/hsp70組表達(dá)明顯升高；XPG在紫外線照射的高劑量時，A549/hsp70組表達(dá)明顯升高；ERCC1在紫外線照射低劑量時，A549/hsp70組表達(dá)明顯升高。 (5)UVC照射下，Hsp70蛋白與DNA核苷酸

10、切除修復(fù)酶基因XPA、XPB、XPF、XPG、ERCC1mRNA表達(dá)之間存在相關(guān)關(guān)系，而Hsp70蛋白與XPCmRNA表達(dá)之間未發(fā)現(xiàn)相關(guān)關(guān)系。 本研究的創(chuàng)新之處在于：(1)同時使用了Hsp70升高和降低的細(xì)胞模型，為探討Hsp70的功能提供有力的依據(jù)，可以從正反兩個方面同時驗(yàn)證Hsp70的功能和作用；(2)同時考慮到了Hsp70在DNA的損傷和修復(fù)過程中的作用，而不是單純的損傷或修復(fù)。 本課題有待深入研究的方面有：(1)

11、關(guān)于Hsp70表達(dá)抑制的模型，應(yīng)該進(jìn)一步用特異性的手段。針對RNAi技術(shù)存在的一些問題加以改進(jìn)，比如繼續(xù)篩選更加有效的siRNA序列、通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選低Hsp70表達(dá)穩(wěn)定的細(xì)胞株來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；(2)Hsp70與DNA修復(fù)的關(guān)系還有待于進(jìn)一步的研究和探索，尤其是Hsp70參與DNA修復(fù)的具體機(jī)制還有待于證實(shí)；(3)可以通過激光共聚焦、染色質(zhì)免疫沉淀等方法來檢測Hsp70蛋白與DNA修復(fù)酶之間的交互作用；(4)DNA整體修復(fù)能力的測定如何應(yīng)用