中波段紫外線誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷及損傷修復(fù)中鈣信號的研究.pdf

1、UVB是中波段紫外線，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷、細(xì)胞周期抑制等。不同劑量的UVB對細(xì)胞造成不同程度的損傷、導(dǎo)致不同的生物效應(yīng)，這些事件中都涉及到各種信號通路的激活。鈣離子作為細(xì)胞胞內(nèi)第二信使，在傳遞信息、調(diào)控細(xì)胞生理功能上具有重要作用。因此，研究UVB誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷及損傷修復(fù)過程中鈣信號的變化顯得尤為重要。 本論文采用比率熒光成像系統(tǒng)檢測不同劑量UVB對細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)的影響，同時研究了不同的胞外環(huán)境對鈣

2、離子濃度變化的影響；采用彗星實(shí)驗(yàn)檢測不同劑量UVB誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷及損傷修復(fù)；最后，利用細(xì)胞計數(shù)的方法檢測了不同劑量UVB對細(xì)胞增殖速度的影響。 主要內(nèi)容如下：1、建立并優(yōu)化比率熒光成像系統(tǒng)檢測Hepa1-6細(xì)胞[Ca2+]i的實(shí)驗(yàn)方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：采用0.1μmol/L的Fura-2/AM避光標(biāo)記Hepa1-6細(xì)胞20min可得到理想的熒光圖象，采用Rmin=1、Rmax=2.02計算細(xì)胞[Ca2+]i，可得穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)

3、果。 2、采用優(yōu)化的比率熒光成像系統(tǒng)，分別在即時和延時對不同劑量UVB引起的細(xì)胞[Ca2+]i的變化進(jìn)行了檢測。即時檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在0.88J/m2-92.4J/m2劑量范圍內(nèi)，UVB誘導(dǎo)[Ca2+]i濃度升高，且隨照射劑量的增加而升高；延時0.5h-4h檢測發(fā)現(xiàn)，當(dāng)UVB照射Hepa1-6細(xì)胞2s時，[Ca2+]i隨孵育時間的延長表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢。UVB照射Hepa1-6細(xì)胞60、170s時，[Ca2+]i隨孵育時間

4、的延長表現(xiàn)出先降低后升高再降低的趨勢。同時檢測了不同胞外環(huán)境對UVB照射引起的細(xì)胞[Ca2+]i變化的影響，結(jié)果推斷細(xì)胞胞內(nèi)鈣庫可能是胞內(nèi)鈣離子濃度升高的主要來源。 3、利用彗星實(shí)驗(yàn)研究了不同劑量UVB誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷及損傷修復(fù)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)照射劑量為1.76J/m2時，即可檢測到最小的DNA損傷，隨著照射強(qiáng)度的增加，DNA損傷加?。坏?dāng)照射劑量增加到52.4J/m2時，DNA損傷到達(dá)檢測的最高限；隨著照射時間的進(jìn)一步延

5、長，DNA損傷沒有表現(xiàn)出增加的趨勢。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞DNA損傷存在檢測的低限，且不同細(xì)胞的低限劑量不同，Hepa1-6細(xì)胞DNA損傷檢測低限為1.76J/m2(4s)，而小鼠肝細(xì)胞DNA損傷檢測低限為7.92J/m2(18s)。同時延時的修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)孵育時間為1h時，表現(xiàn)出修復(fù)效應(yīng)，并隨著照射時間的延長表現(xiàn)出更大的修復(fù)效應(yīng)。當(dāng)修復(fù)時間延長到4h時，修復(fù)效應(yīng)達(dá)到最大值，繼續(xù)增加修復(fù)時間，發(fā)現(xiàn)修復(fù)效應(yīng)進(jìn)入平臺。

6、 4、利用細(xì)胞計數(shù)的方法檢測了不同劑量UVB對細(xì)胞增殖速度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)小劑量(0.88J/m2)UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞，其增殖速度沒有受到顯著影響；增大UVB劑量(74.8J/m2)，細(xì)胞增殖速度受到顯著影響。 通過上述實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)UVB可以誘導(dǎo)Hepa1-6細(xì)胞的DNA損傷，且損傷表現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)，存在檢測的低限和高限；細(xì)胞經(jīng)過孵育后，中劑量照射引起的損傷可以得到一定程度的修復(fù)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明UVB在誘導(dǎo)細(xì)胞DNA發(fā)