核糖核苷酸還原酶M2亞基在結(jié)腸直腸癌及紫外線誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)中的重要作用.pdf

1、目的：
　　 研究核糖核苷酸還原酶M2在結(jié)腸直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及紫外線誘導(dǎo)的直腸結(jié)腸癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)中的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 (1)應(yīng)用免疫組化染色技術(shù)（Immunohistochemical staining）對組織芯片(Tissue microarray)進(jìn)行染色，觀察核糖核苷酸還原酶M2（RRM2）在結(jié)腸直腸癌組織中的表達(dá);應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶連反應(yīng)(PCR)和蛋白質(zhì)印跡(Westernblo

2、t)技術(shù)分別觀察核糖核苷酸還原酶M2在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)情況。
　　 (2)培養(yǎng)HCT116，SW480和SW620等七株結(jié)腸直腸癌細(xì)胞株，細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒(CCK-8)檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀V-FITC（異硫氰酸熒光素）/腆化丙啶(PI)雙標(biāo)記法對不同處理的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期和凋亡的分析。
　　 (3) Transwell小室實(shí)驗(yàn)評估轉(zhuǎn)染后結(jié)腸直腸癌細(xì)胞遷移能力和侵襲能力。
　　 (4)將經(jīng)過

3、不同處理的細(xì)胞置于254nm紫外線燈的照射下，觀察下調(diào)/抑制核糖核苷酸還原酶M2表達(dá)后細(xì)胞對紫外線輻射的敏感度。
　　 (5)短發(fā)卡RNA(shRNA)干擾并下調(diào)RRM2的表達(dá)，分別觀察真核生物胞質(zhì)伴侶素(chaperonin containing TCP1 complex，CCT)ζ-1和Polo-樣激酶1(PLK1)的表達(dá)情況。免疫共沉淀( Coimmunoprecipitation，Co-IP)技術(shù)觀察CCTζ-1，PLK

4、1和RRM2三個(gè)蛋白之間的相互關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 (1)結(jié)腸直腸癌組織中RRM2的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(P＜0.05)，且與浸潤深度(P＜0.05)、低分化程度(P＝0.0051)、TNM分期(P=0.0015)均具相關(guān)性;
　　 (2) HCT116細(xì)胞中RRM2呈現(xiàn)高表達(dá)，下調(diào)RRM2表達(dá)后，其增殖能力較對照組明顯下降(P＜0.05)
　　 (3)在遷徙實(shí)驗(yàn)中，RRM2干擾組穿膜細(xì)胞數(shù)為（

5、11±2）個(gè)，低于陰性對照組[(29±4)個(gè)]和空白對照組[(23±3)個(gè)](P＜0.01）。在侵襲試驗(yàn)中，RRM2干擾組穿膜細(xì)胞數(shù)為（81±3）個(gè)，低于陰性對照組[(289±7)個(gè)]和空白對照組[（301±7.2）個(gè)](P＜0.01)。
　　 (4)下調(diào)核糖核苷酸還原酶M2表達(dá)后結(jié)腸直腸癌細(xì)胞對紫外線輻射的敏感度增強(qiáng)。
　　 (5)短發(fā)卡RNA(shRNA)干擾并下調(diào)RRM2的表達(dá)后，真核生物胞質(zhì)伴侶素ζ-1(CCTζ

6、-1)和Polo-樣激酶1(PLK1)的表達(dá)水平也出現(xiàn)降低，提示Plk1，CCTζ-1可能是RRM2的下游蛋白;免疫共沉淀提示CCTζ-1可以與RRM2抗體共沉淀。同時(shí)，課題組觀察到抑制PLK1的表達(dá)可以降低細(xì)胞的增殖能力，并誘導(dǎo)凋亡。下調(diào)而CCTζ-1不能誘導(dǎo)凋亡。
　　 (6)干擾并下調(diào)PLK1的表達(dá)可以降低結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的侵襲能力，而僅沉默CCTζ-1則不能降低結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的侵襲能力。
　　 結(jié)論：